核受體FXR下調(diào)載脂蛋白M表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、研究背景：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是威脅人類(lèi)健康的常見(jiàn)的心腦血管疾病，在東西方人群中都有較高的發(fā)病率。而脂代謝異常是AS發(fā)生的重要原因，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明。法尼酯X受體(Farnesoid X receptor, FXR)作為一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)許多靶基因的表達(dá)，它是核受體超家族成員之一;在肝、小腸、腎上腺皮質(zhì)等組織細(xì)胞中高表達(dá)，同時(shí)可以參與調(diào)節(jié)膽汁酸代謝、脂代謝、糖代謝、和膽固醇等代謝。

2、r>　　載脂蛋白M(apolipoproteinM，apoM)是新近發(fā)現(xiàn)的一種載脂蛋白，在肝細(xì)胞、腎上管上皮細(xì)胞高表達(dá)，主要分布于血漿高密度脂蛋白（HDL）中，參與前βHDL形成及膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)而具有抗AS作用。
　　本課題組前期研究顯示:在HepG2和L02細(xì)胞中，已證實(shí)活化FXR可明顯下調(diào)apoM分子的表達(dá)，當(dāng)抑制FXR活性后，apoM表達(dá)則增加。這證明了apoM極有可能是FXR作用的新靶基因，對(duì)進(jìn)一步闡明FXR下調(diào)apoM分

3、子在AS發(fā)生發(fā)展中的作用，為防治AS提供新的治療途徑。
　　研究目的：探討FXR下調(diào)apoM表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。
　　研究方法：(1)經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)方法，在線分析apoM基因啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)FXR可能的結(jié)合序列，初步確定apoM啟動(dòng)子區(qū)的FXR結(jié)合位點(diǎn)的范圍。后通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)分析在細(xì)胞內(nèi)FXR和apoM基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)序列的相互作用。
　

4、　(2)構(gòu)建apoM小干擾RNA(apoM-siRNA)處理HepG2和L02細(xì)胞，Real time PCR法檢測(cè)在HepG2和L02細(xì)胞中apoM mRNA表達(dá);Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后HepG2和L02細(xì)胞apoM蛋白的表達(dá);ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后HepG2細(xì)胞中apoA-Ⅱ蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：(1)通過(guò)分析apoM基因啟動(dòng)子區(qū)上游3000bp序列，得到了FXR可能結(jié)合位點(diǎn)DR2，本課題組前期

5、研究顯示:擴(kuò)增apoM啟動(dòng)子區(qū)(-1900～-1800)區(qū)域，該區(qū)域包含預(yù)測(cè)的DR2位點(diǎn);經(jīng)FXR激動(dòng)劑CDCA處理HepG2細(xì)胞后，進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果是加入抗FXR抗體的實(shí)驗(yàn)組，擴(kuò)增了長(zhǎng)為177bp包含apoM啟動(dòng)子區(qū)-1863bp處DR2的序列(-1900～-1800)，而陰性對(duì)照組未有明顯擴(kuò)增。
　　(2) apoM-siRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞24-48 h后，與對(duì)照組相比，apoM的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下

6、降;FXR的拮抗劑Guggulsterone(GS)（終濃度10μM）處理細(xì)胞16-18后，結(jié)果顯示GS處理組與對(duì)照組相比，apoA-Ⅰ蛋白的表達(dá)明顯上升，（P＜0.05）;GS作用轉(zhuǎn)染apoM-siRNA(+)的HepG2細(xì)胞與GS處理組相比，apoA-Ⅰ蛋白的表達(dá)明顯下降。
　　結(jié)論：(1)在HepG2細(xì)胞中，F(xiàn)XR可以和人apoM啟動(dòng)子區(qū)含有DR2的序列(-1900～-1800)結(jié)合，F(xiàn)XR有可能通過(guò)和DR2的序列(-190