穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)銅綠假單胞菌BF形成及QS系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　1．觀察穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌生物被膜（BF）形成的干預(yù)作用，并分析藥物對(duì) BF的干預(yù)作用與細(xì)菌群體感應(yīng)（QS）系統(tǒng)的相關(guān)性，在分子水平探討穿心蓮內(nèi)酯的作用機(jī)制。
　　2．觀察穿心蓮內(nèi)酯提高左氧氟沙星抗 BF陽(yáng)性銅綠假單胞菌活性的作用，探討穿心蓮內(nèi)酯作為抗菌增效劑的可行性。
　　方法:
　　1．以銅綠假單胞菌PAO1野生株為研究對(duì)象，首先采用電鏡技術(shù)（掃描電鏡SEM和透射電鏡TEM）觀察穿心蓮內(nèi)酯在

2、300、30、3μg·mL－1劑量下對(duì)PAO1所生成的BF形態(tài)學(xué)的影響；其次采用96孔板定量測(cè)定法，定量檢測(cè)穿心蓮內(nèi)酯在300、250、200、150、100、50、25、15、10、5μg·mL－110個(gè)劑量下，對(duì)72 h內(nèi)PAO1形成BF厚度的影響；最后構(gòu)建體外BF滲透模型，觀察穿心蓮內(nèi)酯在300、30、3μg·mL－1劑量下，在構(gòu)建的BF模型上對(duì)左氧氟沙星滲透性的影響。以此綜合分析和評(píng)價(jià)穿心蓮內(nèi)酯對(duì)銅綠假單胞菌 BF的干預(yù)作用。<

3、br>　　2．采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR(Real-Time PCR)技術(shù)觀察穿心蓮內(nèi)酯在150、75、37.5μg·mL－1劑量下對(duì)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)中相關(guān)基因lasR和rhlR，以及調(diào)節(jié)基因pvdQ的mRNA表達(dá)水平的影響，分析藥物對(duì)BF的干擾是否與QS系統(tǒng)相關(guān)。
　　3．采用傳統(tǒng)的體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，觀察穿心蓮內(nèi)酯與左氧氟沙星不同配比的22個(gè)樣品對(duì)160株臨床近期分離BF陽(yáng)性銅綠假單胞菌的MIC值，并采用概率單位分析法，對(duì)受試

4、藥物效價(jià)強(qiáng)度進(jìn)行擬合，以殘差平方和和相關(guān)系數(shù)為主要判別，進(jìn)行線性、對(duì)數(shù)性、Emax和Sigmod Emax的對(duì)比，評(píng)價(jià)不同配比受試藥物的抗菌活性；以PAO1構(gòu)建小鼠銅綠假單胞菌腹腔感染模型，觀察體外抗菌活性較強(qiáng)的13個(gè)配比受試藥物的體內(nèi)抗感染作用。
　　4．采用體內(nèi)炭粒廓清實(shí)驗(yàn)，以吞噬指數(shù)為指標(biāo)觀察穿心蓮內(nèi)酯對(duì)正常小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞吞噬功能的影響；采用巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察穿心蓮內(nèi)酯體外對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響。
　　結(jié)果

5、:
　　1．SEM結(jié)果顯示，空白對(duì)照組PAO1附著于玻璃載體表面在72 h可形成分化成熟、較厚、結(jié)構(gòu)不均勻并密布有孔狀通道的BF， TEM鏡下可見(jiàn)PAO1聚集生長(zhǎng)，菌體邊緣清晰，周圍可見(jiàn)呈團(tuán)塊，形態(tài)似“塔狀”或“蘑菇狀”的不規(guī)則BF結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)明顯的培養(yǎng)基染色顆粒。穿心蓮內(nèi)酯3μg·mL－1劑量下,PAO1產(chǎn)生的BF未能形成成熟的結(jié)構(gòu)，BF明顯稀薄且平整，可見(jiàn)附著的PAO1菌體， TEM鏡下PAO1有一定的聚集，可見(jiàn)少量“蘑菇狀”B

6、F結(jié)構(gòu)，但較小且不明顯；在穿心蓮內(nèi)酯30、300μg·mL－1劑量下，PAO1分散附著，均未見(jiàn)明顯的BF結(jié)構(gòu)，TEM鏡下PAO1多數(shù)分散生長(zhǎng)，少見(jiàn)聚集，菌體邊緣不清晰，周圍有大量顆粒狀物質(zhì)。
　　2．穿心蓮內(nèi)酯在300、250、200、150、100、50、25、20、10、5μg·mL－110個(gè)劑量下，72 h內(nèi)均可影響 PAO1 BF的生長(zhǎng)。穿心蓮內(nèi)酯在20μg·mL－1以上劑量下，12、24、36、48、60、72 h時(shí) B

7、F厚度明顯變薄。
　　3．BF滲透性實(shí)驗(yàn)顯示，穿心蓮內(nèi)酯在300、30、3μg·mL-1劑量下均可以提高銅綠假單胞菌生物被膜模型對(duì)左氧氟沙星的滲透性，在模型構(gòu)建后的2、4、6、8、10、24 h的藥物滲透量顯著升高。
　　4.實(shí)時(shí)定量熒光PCR測(cè)定結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯在150μg·mL-1濃度下增強(qiáng)lasR基因表達(dá)，30、3μg·mL-1劑量下則降低其表達(dá)；穿心蓮內(nèi)酯在300、30和3μg·mL-1的劑量下均可降低rhlR和

8、pvdQ基因的表達(dá)；
　　5.體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在左氧氟沙星比穿心蓮內(nèi)酯在1:0.001～1:0.01范圍內(nèi)，藥物的Emax和 ED50雖然有一定的波動(dòng)，但總體趨勢(shì)上表現(xiàn)出Emax高于單用左氧氟沙星和ED50低于單用左氧氟沙星，表明穿心蓮內(nèi)酯在一定劑量范圍內(nèi)有提高左氧氟沙星抗菌活性的作用。體內(nèi)細(xì)菌感染保護(hù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所觀察的13組配方對(duì)銅綠假單胞菌小鼠感染模型的體內(nèi)保護(hù)性作用均優(yōu)于左氧氟沙星單用。體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表