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文檔簡介
1、妊娠初期,滋養(yǎng)細(xì)胞具有獨(dú)特的類似腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為,即高增殖、低凋亡和高遷移及侵襲力;同時(shí)滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為受到蛻膜微環(huán)境的嚴(yán)格調(diào)控,這對囊胚植入、胚胎發(fā)育和正常妊娠的維持起關(guān)鍵作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激參與多種病理性妊娠的發(fā)病,與流產(chǎn)、先兆子癇、胎兒生長受限(FGR)、早產(chǎn)及死胎等妊娠并發(fā)癥密切關(guān)聯(lián)。過量的活性氧自由基(ROS)可使磷脂中的不飽和脂肪酸生成過氧化脂質(zhì),損傷生物膜;可以抑制蛋白質(zhì)功能,破壞核酸及染色質(zhì),從而傷害機(jī)
2、體的各種組織和細(xì)胞,包括導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡,降低細(xì)胞侵襲力。因此,控制氧化損傷對于成功妊娠和正常妊娠的維持具有重要意義。
環(huán)孢素A(CsA)是具有劃時(shí)代意義的免疫抑制劑,其臨床應(yīng)用可顯著改善實(shí)體器官移植的近期存活率,是器官移植后免疫抑制和抗排斥反應(yīng)的首選藥物。我們課題組首次發(fā)現(xiàn),低濃度CsA可顯著提高滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖與侵襲力,抑制低血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡,并改善小鼠流產(chǎn)模型的妊娠結(jié)局,提示CsA可能為滋養(yǎng)細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致的
3、妊娠疾病的潛在治療藥物。與CsA經(jīng)典的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不同,我們課題組的研究結(jié)果顯示,CsA可通過活化MAPK/ERK通路提高滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖及侵襲力。
本研究在前期工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究在細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)控中起重要作用的粘著斑激酶(FAK)信號通路是否參與CsA調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移與侵襲;并通過用H2O2處理人絨毛膜上皮癌細(xì)胞系JEG-3細(xì)胞,建立滋養(yǎng)細(xì)胞氧化損傷的體外模型,在氧化應(yīng)激條件下進(jìn)一步解析CsA減輕滋養(yǎng)細(xì)胞損傷
4、的分子機(jī)制,以及相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,為拓展CsA的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
第一部分環(huán)孢素A通過FAK信號通路促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移與侵襲
目的:探討FAK信號通路是否參與介導(dǎo)CsA促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞遷移與侵襲,以及FAK信號通路與ERK信號通路間的相互作用。
方法:用CsA(1μM)處理滋養(yǎng)細(xì)胞,或用FAK抑制劑Y15、Src抑制劑PP2、MEK抑制劑U0126分別預(yù)處理滋養(yǎng)細(xì)胞后再用CsA處理,采用
5、Transwell遷移試驗(yàn)和Matrigel侵襲試驗(yàn)分析滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移及侵襲力,Western blot分析滋養(yǎng)細(xì)胞FAK、Src及ERK的磷酸化水平及E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和金屬基質(zhì)蛋白酶MMP2、MMP9的表達(dá)水平,明膠酶譜實(shí)驗(yàn)分析滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清MMP2、MMP9的活性。
結(jié)果:CsA可顯著提高原代滋養(yǎng)細(xì)胞及JEG-3細(xì)胞FAK及其接頭分子Src的磷酸化水平。Y15和PP2均能阻斷CsA升調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的
6、遷移及侵襲。Y15和PP2可抑制CsA增高的FAK、Src及ERK的磷酸化水平,U0126可抑制CsA增高的ERK磷酸化水平,但對FAK及Src的磷酸化水平無顯著影響。Y15、PP2和U0126均可消除CsA對E-cadherin表達(dá)的下調(diào)作用和對MMP2、MMP9表達(dá)及活性的上調(diào)作用。
結(jié)論:CsA通過FAK-Src信號通路促進(jìn)ERK信號通路活化,下調(diào)E-cadherin表達(dá),上調(diào)MMP2、MMP9的表達(dá)及分泌,進(jìn)而促進(jìn)
7、滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲。
第二部分氧化應(yīng)激損傷滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為
目的:分析H2O2對JEG-3細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,建立滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。
方法:用不同濃度的H2O2處理JEG-3細(xì)胞24 h,采用MTT法分析滋養(yǎng)細(xì)胞活力,倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),DHE熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平,JC-1熒光探針檢測細(xì)胞線粒體膜電位,Annexin V/PI雙標(biāo)記檢測細(xì)胞早期凋亡,M
8、atrigel侵襲試驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲力,以建立滋養(yǎng)細(xì)胞氧化損傷模型。
結(jié)果:500μM H2O2處理JEG-3細(xì)胞24 h后,細(xì)胞活力顯著下降,形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞皺縮,間隙增大,體積減小,細(xì)胞核縮小,染色質(zhì)凝集,呈顆粒團(tuán)塊狀分布;細(xì)胞ROS產(chǎn)生增加,線粒體膜電位下降,凋亡比例升高,細(xì)胞侵襲力顯著下降。更高濃度的H2O2(從750μM開始)則誘發(fā)細(xì)胞大量脫落壞死,侵襲力喪失。
結(jié)論:JEG-3細(xì)胞經(jīng)500μ
9、M H2O2處理24 h呈現(xiàn)明顯的氧化應(yīng)激損傷,用此條件建立氧化應(yīng)激模型,為研究滋養(yǎng)細(xì)胞氧化損傷及抗氧化應(yīng)激藥物的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
第三部分環(huán)孢素A緩解氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞損傷
目的:解析CsA對H2O2誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)行為損傷的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。
方法:用低濃度CsA(1μM)預(yù)處理JEG-3細(xì)胞24h,再經(jīng)H2O2(500μM)刺激誘導(dǎo)氧化損傷,采用MTT比色法分析滋養(yǎng)細(xì)胞活力,
10、倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),Annexin V/PI雙標(biāo)記檢測細(xì)胞早期凋亡,Matrigel侵襲試驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲力,DHE熒光探針檢測細(xì)胞ROS水平,化學(xué)比色法檢測細(xì)胞丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)及過氧化氫酶(CAT)的活性,JC-1熒光探針檢測細(xì)胞線粒體膜電位,Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
結(jié)果:與H2O2單獨(dú)處理組比較,JEG-3細(xì)胞經(jīng)低濃度CsA干預(yù)后,細(xì)胞活
11、力明顯升高,形態(tài)得以改善;細(xì)胞凋亡比例下降,侵襲力增加;細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA含量明顯下降,SOD、CAT的活性顯著升高:線粒體膜電位水平恢復(fù);p53的表達(dá)和磷酸化水平下降,Bax表達(dá)減少,Bcl-2表達(dá)增加,caspase-3前體增多,裂解的PARP大片段減少。
結(jié)論:CsA干預(yù)可明顯改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下JEG-3細(xì)胞的生物學(xué)行為;減輕細(xì)胞氧化損傷程度,增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化損傷能力;抑制線粒體相關(guān)的凋亡信號通路及caspase-
12、3活化,減少滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。
第四部分環(huán)孢素A通過調(diào)節(jié)FAK-Sre和MAPK信號通路緩解滋養(yǎng)細(xì)胞氧化損傷
目的:解析CsA緩解滋養(yǎng)細(xì)胞氧化損傷的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
方法:用低濃度CsA(1μM)處理JEG-3細(xì)胞24h,再經(jīng)H2O2(500μM)刺激誘導(dǎo)氧化損傷,采用Western blot分析CsA對氧化應(yīng)激的滋養(yǎng)細(xì)胞FAK、Src及MAPKs磷酸化水平的影響;在此基礎(chǔ)上,用FAK抑制劑Y15、S
13、rc抑制劑PP2分別預(yù)處理處理JEG-3細(xì)胞,MTT法測定細(xì)胞活力,DHE熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平,JC-1熒光探針檢測細(xì)胞線粒體膜電位,Annexin V/PI雙標(biāo)記檢測細(xì)胞早期凋亡,Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲力;用MAPKs信號通路抑制劑(SB203580、SP600125、U0126)分別預(yù)處理JEG-3細(xì)胞,MTT法分析細(xì)胞活力。
結(jié)果:H2O2刺激可引起JEG-3細(xì)胞FAK、Src磷酸化水平下降,
14、p38 MAPK、JNK和ERK的磷酸化水平升高。CsA預(yù)處理JEG-3細(xì)胞后再經(jīng)H2O2刺激,F(xiàn)AK、Src磷酸化水平明顯升高,p38 MAPK、JNK磷酸化水平明顯下降,ERK磷酸化水平無顯著性變化。Y15和PP2處理細(xì)胞后,再經(jīng)CsA和H2O2聯(lián)合處理,與CsA和H2O2聯(lián)合處理組比較,滋養(yǎng)細(xì)胞活力下降,ROS產(chǎn)生增加,線粒體膜電位下降,凋亡比例升高,侵襲力下降。p38 MAPK抑制劑SB203580或JNK抑制劑SP600125
15、處理細(xì)胞后,再經(jīng)H2O2處理,滋養(yǎng)細(xì)胞活力較H2O2處理組升高;而MEK抑制劑U0126處理后,細(xì)胞活力進(jìn)一步下降。
結(jié)論:低濃度CsA通過促進(jìn)FAK-Src信號通路活化,抑制p38 MAPK和JNK信號通路活化,發(fā)揮對氧化損傷的滋養(yǎng)細(xì)胞的保護(hù)作用。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)低濃度CsA對人滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)行為具有多重調(diào)節(jié)作用:(1)通過FAK-Src信號通路促進(jìn)ERK信號通路活化,下調(diào)E-cadherin表達(dá),
16、上調(diào)MMP2、MMP9的表達(dá)及分泌,促進(jìn)正常滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲;(2)通過降調(diào)節(jié)ROS及MDA的生成,升調(diào)節(jié)SOD和CAT的活性,緩解滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷;(3)通過抑制線粒體相關(guān)的凋亡通路,降低caspase-3活化水平,抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡;(4)通過促進(jìn)FAK-Src信號通路活化,抑制p38 MAPK和JNK信號通路活化,發(fā)揮對氧化損傷的滋養(yǎng)細(xì)胞的保護(hù)作用。這些研究結(jié)果顯示,CsA的藥理作用及其細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路遠(yuǎn)超過
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