神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)減輕氧化應(yīng)激損傷的新機(jī)制.pdf

1、神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)（Neuronal Redox Homeostasis）是神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)抗氧化物和氧化物間一種相對(duì)含量。如果神經(jīng)元內(nèi)氧化物含量增加過多，可大量消耗抗氧化物，神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)可被打破，繼而引起神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生氧化損傷和凋亡。因此，維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)對(duì)減輕氧化應(yīng)激損傷意義重大。
　　氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要原因，包括阿爾茲海默病（Alzheimer’ disease，AD）、帕金森?。≒arkinson’s

2、 disease，PD）和缺血性腦卒中（Ischemic Stroke）。氧化應(yīng)激損傷可引起神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活，繼而可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）功能損害。使用抗氧化劑是減輕氧化應(yīng)激損傷的有效手段。我國(guó)有使用天然抗氧化劑的傳統(tǒng)，早在公元前，中國(guó)人就有飲用綠茶（含天然抗氧化劑茶多酚）的記載。然而，遺憾的是，被認(rèn)為具有較強(qiáng)抗氧化作用的常見抗氧化劑，如茶多酚、維生素C、維生素E和β-

3、胡蘿卜素等，其大樣本多中心臨床試驗(yàn)結(jié)果均為陰性?？寡趸瘬p傷機(jī)制不清是其重要因素之一。
　　研究表明，天然大麻素四氫大麻酚（Tetrahydrocannabinol，THC）和人工合成大麻素（WIN55212-2）可通過減輕氧化應(yīng)激損傷，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。但由于THC具有較強(qiáng)的成癮性，而WIN55212-2長(zhǎng)期使用所導(dǎo)致的神經(jīng)精神癥狀，大大限制了其臨床應(yīng)用。Anandamide（AEA）是一種內(nèi)源性大麻素，可通過激活大麻素受體產(chǎn)生神

4、經(jīng)保護(hù)作用，但AEA是否可減輕氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)元損傷，其抗氧化損傷機(jī)制如何，目前尚不清楚。
　　阿米福?。ˋmifostine）是一種臨床常用的抗放療損傷藥物，目前用于減輕X射線和化療藥物對(duì)惡性腫瘤病人正常組織的損傷。在外周組織的研究中發(fā)現(xiàn)，阿米福汀具有抗氧化應(yīng)激損傷作用，但阿米福汀是否可通過維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)發(fā)揮抗氧化作用，目前未見報(bào)道。
　　本研究旨在通過觀察AEA和阿米福汀的神經(jīng)保護(hù)作用，從維持神經(jīng)元細(xì)胞還原穩(wěn)態(tài)角度

5、，分別探討其保護(hù)機(jī)制。
　　第一部分大麻素AEA的抗氧化神經(jīng)保護(hù)機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)一尋找適宜AEA保護(hù)濃度并觀察AEA對(duì)神經(jīng)元CB1受體表達(dá)的影響
　　目的：尋找適宜AEA細(xì)胞保護(hù)濃度并觀察其對(duì)神經(jīng)元CB1受體表達(dá)的影響。
　　方法：我們將HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系暴露于含H2O2的DMEM培養(yǎng)基，模擬氧化應(yīng)激損傷。為確定AEA適宜濃度，我們將HT22細(xì)胞分為6組，分別為正常培養(yǎng)的對(duì)照組（Control）、200μ

6、M H2O2損傷組和不同濃度AEA（1、5、10和20μM）的保護(hù)組。孵育3 h后，根據(jù)MTT值，確定適宜AEA濃度。隨后，將細(xì)胞分為5組，分別為Control組、H2O2損傷組、AEA保護(hù)組、CB1拮抗劑AM251干預(yù)組和AM251單獨(dú)使用組，采用Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察細(xì)胞CB1受體表達(dá)情況。
　　結(jié)果：與H2O2損傷組相比，10μM和20μM的AEA可顯著提高細(xì)胞活力（P<0.05）。此外，AEA可顯著上

7、調(diào)HT22細(xì)胞CB1受體表達(dá)（P<0.05），CB1拮抗劑AM251逆轉(zhuǎn)了AEA對(duì)CB1表達(dá)的上調(diào)作用（P<0.05）。
　　結(jié)論：我們選取10μM的AEA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，并且觀察到AEA可上調(diào)HT22細(xì)胞CB1受體表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)二 AEA通過CB1受體維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)
　　目的：探討大麻素CB1受體在AEA維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)中的作用。
　　方法：將細(xì)胞分為5組，分別為Control組、H2O2損傷組、AEA保

8、護(hù)組、CB1拮抗劑AM251干預(yù)組和AM251單獨(dú)使用組。孵育3 h后，通過分析細(xì)胞活力、乳酸脫氫酶（Lactic Dehydrogenase，LDH）釋放量、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞凋亡率，評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷程度；通過相應(yīng)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、還原型谷胱甘肽（Reduced Glutathione，GSH）和氧化型谷胱甘肽（

9、Oxidized Glutathione，GSSG）含量，評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)抗氧化物和氧化物水平。隨后，使用CB1-siRNA，觀察其對(duì)AEA保護(hù)作用的影響。此外，我們還使用大鼠右側(cè)中腦動(dòng)脈閉塞模型（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO），通過在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了AEA的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　結(jié)果：AEA減輕了H2O2對(duì)HT22細(xì)胞的損傷，并降低了細(xì)胞凋亡，增加了細(xì)胞內(nèi)抗氧化物SOD和GSH水平，降低了

10、氧化物ROS和GSSG含量（P<0.05），AEA產(chǎn)生的上述作用被CB1拮抗劑或CB1-siRNA顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05）。AEA對(duì)腦缺血大鼠產(chǎn)生的腦保護(hù)作用，也被CB1拮抗劑AM251逆轉(zhuǎn)（P<0.05）。
　　結(jié)論：AEA通過CB1受體，維持神經(jīng)元還原穩(wěn)態(tài)并發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)三 NADPH氧化酶2在AEA產(chǎn)生抗氧化作用中的機(jī)制
　　目的：探索NODPH氧化酶2（Nox2）在AEA產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激中的作用。<

11、br>　　方法：用Western blot和Real-Time PCR檢測(cè)AEA對(duì)Nox2蛋白表達(dá)和基因轉(zhuǎn)錄的影響。隨后，將HT22細(xì)胞分為5組，分別為Control組、H2O2損傷組、AEA保護(hù)組、Nox抑制劑Apocynin干預(yù)組和Apocynin單獨(dú)給藥組，通過Western blot檢測(cè)Nox2表達(dá)，MTT和LDH釋放量評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷水平。
　　結(jié)果：與Control組相比，H2O2可顯著上調(diào)HT22細(xì)胞Nox2蛋白表達(dá)和基

12、因轉(zhuǎn)錄水平（P<0.05），AEA下調(diào)了Nox2的基因表達(dá)和蛋白轉(zhuǎn)錄水平（P<0.05），CB1拮抗劑AM251或CB1-siRNA顯著逆轉(zhuǎn)了AEA的上述作用（P<0.05）。此外，我們發(fā)現(xiàn)Nox抑制劑未對(duì)AEA產(chǎn)生的細(xì)胞保護(hù)作用和抑制Nox2蛋白表達(dá)作用產(chǎn)生顯著影響（P>0.05）。
　　結(jié)論：Nox2介導(dǎo)了AEA對(duì)HT22細(xì)胞產(chǎn)生的抗氧化應(yīng)激作用。
　　第二部分細(xì)胞保護(hù)劑阿米福汀維持PC12細(xì)胞還原穩(wěn)態(tài)的機(jī)制
　　

13、目的：探索細(xì)胞保護(hù)劑阿米福?。ˋmifostine，Ami）的抗氧化神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。
　　方法：將PC12細(xì)胞暴露于含有高濃度谷氨酸（Glutamate，Glu）的培養(yǎng)基中，模擬神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷。隨后，將PC12細(xì)胞分為6組，分別為正常培養(yǎng)的Control組、Ami單獨(dú)處理組、Glu損傷組、Ami保護(hù)組、超氧化物歧化酶2干擾 RNA（SOD2-siRNA）干預(yù)組和亂序RNA（SC-siRNA）干預(yù)組，孵育24 h后，通過免疫細(xì)胞

14、化學(xué)和Western blot檢測(cè)細(xì)胞SOD2蛋白表達(dá)水平；采用MTT、LDH釋放量、細(xì)胞形態(tài)和凋亡率，評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷水平。與此同時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞線粒體內(nèi)超氧化物、細(xì)胞內(nèi)ROS、GSH和過氧化氫酶（Catalase，CAT）水平。
　　結(jié)果：與Control組相比，谷氨酸可下調(diào)PC12細(xì)胞SOD2蛋白表達(dá)，損傷細(xì)胞，增加線粒體內(nèi)超氧化物和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ROS水平，并消耗細(xì)胞內(nèi)GSH和CAT（P<0.05）。阿米福汀可減輕細(xì)胞損傷程度，上調(diào)SO

15、D2表達(dá)，降低PC12細(xì)胞損傷，下調(diào)細(xì)胞線粒體超氧化物和ROS水平，增加GSH和CAT含量（P<0.05）。SOD2-siRNA顯著逆轉(zhuǎn)了阿米福汀產(chǎn)生的上述細(xì)胞保護(hù)和抗氧化應(yīng)激損傷作用（P<0.05），而 SC-siRNA未對(duì)阿米福汀產(chǎn)生的上述作用造成顯著影響（P>0.05）。
　　結(jié)論：阿米福汀在SOD2介導(dǎo)下，通過維持細(xì)胞還原穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
　　小結(jié)：大麻素AEA在CB1受體介導(dǎo)下，通過抑制神經(jīng)元Nox2蛋白表