金絲桃苷保護(hù)肝細(xì)胞L02氧化應(yīng)激損傷的分子機(jī)制探討.pdf

1、研究背景和目的:
　　氧化應(yīng)激損傷是指機(jī)體在受到藥物、化學(xué)物質(zhì)、重金屬物質(zhì)和電離福射等刺激時(shí),體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和抗氧化防御系統(tǒng)之間的平衡被破壞,使ROS(reactive oxygen species,活性氧自由基)和RNS(reactive nitrogen species,活性氮自由基自由基)等各種高氧化性活性物質(zhì)產(chǎn)生量過(guò)多或者是機(jī)體清除能力不足,從而造成機(jī)體細(xì)胞和組織不同程度損傷的病理和生理學(xué)過(guò)程。ROS或RNS可以通過(guò)直接

2、或間接等方式引起細(xì)胞內(nèi)生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等的化學(xué)修飾,從而影響這些大分子的結(jié)構(gòu)和功能,進(jìn)而影響機(jī)體細(xì)胞、組織和器官乃至整體的結(jié)構(gòu)、代謝和功能。
　　紅系衍生核因子相關(guān)因子-2(nuclear factor-E2-related factor2,Nrf2)是一種對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)(Redox)的變化非常敏感的轉(zhuǎn)錄因子,可誘導(dǎo)多種抗氧化蛋白的基因表達(dá)。在靜息狀態(tài)下,它能夠在胞漿中與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1(Ke

3、lch-like ECH associating protein1,Keap1)蛋白結(jié)合,從而形成Nrf2/Keap1偶聯(lián)復(fù)合體,其活性處于相對(duì)抑制狀態(tài),并可進(jìn)一步由26S蛋白酶體識(shí)別和降解,使Nrf2在細(xì)胞內(nèi)保持較低的水平。當(dāng)發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí),細(xì)胞內(nèi)呈氧化狀態(tài),Keap1分子內(nèi)的巰基被氧化為二硫鍵,Nrf2從復(fù)合體中解離出來(lái),轉(zhuǎn)移入核并能與小Maf蛋白(包括 MafG、MafK和 MafF)形成異二聚復(fù)合體,識(shí)別并結(jié)合到抗氧化反應(yīng)元件(

4、antioxidant response element, ARE)上,對(duì)II相相關(guān)解毒酶及抗氧化酶基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化活性,從而減小氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞或組織造成的損傷,維持機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。
　　BTB-CNC異體同源體1(BTB and CNC homology1,Bach1)同Nrf2一樣屬于CNC轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,是一種亞鐵血紅素結(jié)合蛋白。Bach1與 Nrf2的功能不同,在氧化應(yīng)激中,

5、Bach1可與小 Maf類(lèi)蛋白結(jié)合生成異源二聚體,從而與Maf識(shí)別元件(MARE)相結(jié)合,可以抑制抗氧化蛋白的基因轉(zhuǎn)錄。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),Nrf2和Bach1可以調(diào)控抗氧化基因血紅素加氧酶(Heme oxygenase1,HO-1)的表達(dá),并且二者的作用是相互拮抗的。Nrf2/Keap1-ARE抗氧化系統(tǒng)信號(hào)通路是目前被認(rèn)為細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷的最重要機(jī)制。
　　課題組前期研究發(fā)現(xiàn),天然黃酮類(lèi)物質(zhì)金絲桃苷(Hyp)具有明顯的肝保護(hù)效

6、應(yīng),且與上調(diào)細(xì)胞保護(hù)蛋白水平和增強(qiáng)細(xì)胞保護(hù)蛋白酶活性相關(guān)。本研究擬在進(jìn)一步明確Hyp的肝細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)基礎(chǔ)上,針對(duì) Nrf2與Bach1相互競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HO-1等基因啟動(dòng)子區(qū)域的 ARE,探討Hyp上調(diào)抗氧化蛋白基因表達(dá),發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷效應(yīng)的機(jī)制。研究結(jié)果有助于深入闡述Hyp的抗氧化應(yīng)激損傷機(jī)制,為抗氧化性肝損傷藥物的開(kāi)發(fā)與改造提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.用H2O2處理肝細(xì)胞(L02),建立氧化應(yīng)激損傷模型。
　

7、　2.通過(guò)MTT法檢測(cè)其細(xì)胞活力,檢測(cè)MDA、ROS等反映細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)與氧化應(yīng)激損傷,檢測(cè)Hyp對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷、保護(hù)肝細(xì)胞的時(shí)效、量效關(guān)系。
　　3.RT-PCR和Real-time RT-PCR檢測(cè)Hyp對(duì)H2O2處理的L02細(xì)胞中HO-1的mRNA水平的影響。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)(轉(zhuǎn)染hHO4.9luc質(zhì)粒)研究Hyp對(duì)HO-1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的影響;
　　4.Western Blot檢測(cè) L02細(xì)胞 Nrf

8、2、Bach1和 Keap1蛋白表達(dá)水平,研究 Hyp的作用效果;
　　5.運(yùn)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色分析關(guān)鍵調(diào)控因子Nrf2和Bach1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核表達(dá)分布(即核轉(zhuǎn)位)特點(diǎn);
　　6.通過(guò)構(gòu)建并轉(zhuǎn)染 pEGFP-C1-Bach1表達(dá)載體,上調(diào) L02細(xì)胞 Bach1水平,研究其對(duì)Nrf2和HO-1表達(dá)的影響
　　7.染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)分析 Hyp對(duì)HO-1啟動(dòng)子 ARE區(qū)域Bach1及Nrf2結(jié)合特點(diǎn)的影響。

9、r>　　結(jié)果:
　　1.H2O2能導(dǎo)致L02細(xì)胞活力下降,且效應(yīng)具有濃度依賴(lài)性,當(dāng) H2O2濃度達(dá)到2.5 M時(shí),作用1h能完全抑制L02細(xì)胞的生長(zhǎng),H2O2處理1h抑制L02細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50為0.126 M。L02細(xì)胞預(yù)先經(jīng) Hyp(12.5-800μM)處理24h后,采用0.1M的H2O2處理1h,與正常對(duì)照組相比 Hyp濃度為200、400和800μM時(shí),明顯增強(qiáng)細(xì)胞活力。同時(shí),Hyp顯著削弱H2O2引起細(xì)胞內(nèi)ROS與MD

10、A水平增高。
　　2.L02細(xì)胞用200μM的Hyp預(yù)處理24 h,H2O2誘導(dǎo)1h后。與H2O2模型組相比,Hyp能明顯誘導(dǎo)Nrf2的mRNA水平與蛋白水平上升,且作用呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性,對(duì)Keap1和 Bach1的影響不明顯。Hyp同時(shí)增加 Nrf2和Bach1在細(xì)胞核積聚量,但對(duì)Nrf2的作用更加明顯。
　　3.雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Hyp顯著提升HO-1基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,為對(duì)照組的2.7

11、倍。
　　4.轉(zhuǎn)染pGFP-C1-Bach1表達(dá)載體,上調(diào)Bach1表達(dá)后,顯著降低Nrf2和HO-1水平。
　　5.CHIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),在Bach1和Nrf2相互競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ARE過(guò)程中,Hyp提升Nrf2與ARE的結(jié)合水平,但對(duì)Bach1作用不明顯。
　　結(jié)論
　　1.Hyp對(duì)H2O2誘導(dǎo)的L02肝細(xì)胞氧化性損傷具有保護(hù)效應(yīng)。
　　2.Hyp促進(jìn)HO-1基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性及基因表達(dá)。
　　3. H