慢性間歇性低壓低氧對(duì)發(fā)育大鼠心臟鈣穩(wěn)態(tài)的作用及其細(xì)胞與分子機(jī)制.pdf

1、大量研究表明,慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobarichypoxia,CIHH)對(duì)成年動(dòng)物具有明顯的心臟保護(hù)作用,可有效對(duì)抗急性缺血/再灌注或急性缺氧/復(fù)氧對(duì)心肌的損傷、減少心肌梗死面積、限制心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷,以及抗心律失常。其機(jī)制可能涉及心肌抗氧化能力增強(qiáng)、心肌毛細(xì)血管密度及冠脈血流量增加、熱休克蛋白表達(dá)增加、NO產(chǎn)生增加、抗心肌細(xì)胞凋亡、穩(wěn)定線粒體及鈣處理功能、延長(zhǎng)心肌動(dòng)作電位時(shí)程及有效不應(yīng)

2、期等。有研究報(bào)道,CIHH對(duì)成年大鼠的心臟缺血/再灌注損傷作用與抗鈣超載、保持鈣穩(wěn)態(tài)有關(guān)。但有關(guān)CIHH對(duì)幼年動(dòng)物發(fā)育心臟鈣穩(wěn)態(tài)的作用尚未明了。本研究旨在應(yīng)用功能學(xué)、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)及電生理學(xué)方法探討CIHH對(duì)幼年發(fā)育大鼠鈣穩(wěn)態(tài)的作用及其細(xì)胞和分子機(jī)制。
　　 本研究分為四部分:(1)應(yīng)用Langendor罐流技術(shù)觀察CIHH對(duì)發(fā)育大鼠心臟功能學(xué)及梗死面積的保護(hù)作用;(2)應(yīng)用激光共聚焦顯微熒光技術(shù),觀察CIHH對(duì)發(fā)育大鼠的心

3、室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的影響;(3)應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)觀察CIHH對(duì)鈣處理蛋白表達(dá)的影響;(4)應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗方法觀察CIHH對(duì)發(fā)育大鼠心室肌細(xì)胞鈣離子通道電流和鈉鈣交換電流的影響,探討CIHH對(duì)鈣穩(wěn)態(tài)作用的離子機(jī)制。
　　 Ⅰ慢性間歇性低壓低氧對(duì)發(fā)育大鼠心臟的保護(hù)作用
　　 目的:應(yīng)用Langendorff灌流系統(tǒng)觀察CIHH對(duì)發(fā)育大鼠缺血/再灌注損傷的心臟功能學(xué)及梗死面積的影響。
　　 方法:雄性新生SD大鼠

4、按年齡及體重相匹配分成四組:28天間歇性低壓低氧組(CIHH28)、42天間歇性低壓低氧組(CIHH42)和28天對(duì)照組(CON28)、42天對(duì)照組(CON42)。間歇性低氧處理動(dòng)物置于低壓氧艙,分別接受28天、42天和56天模擬高原3000米(PB=525 mmHg,Po2=108.8 mmHg,5小時(shí)/天)的減壓低氧處理。應(yīng)用langendorff離體心臟灌流技術(shù)描記大鼠離體心臟左室功能,給予30分鐘全心缺血和60分鐘復(fù)灌處理。分別

5、記錄大鼠心臟缺血前及復(fù)灌后不同時(shí)間的左室發(fā)展壓(LVDP)、左室舒張末壓(LVEDP)、最大壓力變化速率(±LV dp/dt)等心功能參數(shù)和冠脈流量(CF)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,測(cè)定測(cè)定其梗死面積。
　　 結(jié)果:
　　 1基礎(chǔ)狀態(tài)下,CIHH大鼠冠脈流量較對(duì)照大鼠明顯增多,其余心功能參數(shù)及梗死面積與對(duì)照大鼠無(wú)差異。缺血再灌注導(dǎo)致動(dòng)物心功能受損、心肌梗死面積增大,但CON與CIHH動(dòng)物間具有明顯差異。CIHH大鼠缺血/再灌注后心臟

6、功能的恢復(fù)明顯好于對(duì)照動(dòng)物,表現(xiàn)為左心室發(fā)展壓(LVDP)和左心室最大壓力變化速率(±LVdp/dtmax)恢復(fù)增加(P＜0.05),左心室舒張末壓(LVEDP)恢復(fù)降低(P＜0.05),梗死面積減小(P＜0.05)。CIHH42大鼠抗心臟缺血再灌注損傷作用強(qiáng)于CIHH28大鼠。
　　 2 L型鈣通道開(kāi)放劑,Bay K8644(0.5μM)和肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放開(kāi)放劑,ryanodine(10 nM)可取消CIHH的心臟保護(hù)作用(P＜

7、0.05)。
　　 小結(jié):CIHH可增強(qiáng)發(fā)育大鼠抗心肌缺血/再灌注損傷的能力,具有明顯的心臟保護(hù)作用。其保護(hù)作用與心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的維持有關(guān),增加外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放均可取消其保護(hù)作用。
　　 Ⅱ慢性間歇性低壓低氧對(duì)發(fā)育大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣的影響
　　 目的:觀察CIHH對(duì)發(fā)育大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣的影響并探討其可能機(jī)制。
　　 方法:雄性新生SD大鼠,根據(jù)年齡及體重相匹配分成四組:28天間歇性低壓低氧組(

8、CIHH28)、42天間歇性低壓低氧組(CIHH42)和28天對(duì)照組(CON28)、42天對(duì)照組(CON42)。CIHH動(dòng)物置于低壓氧艙,分別接受28天和42天模擬高原3000米(PB=525 mmHg,Po2=108.8mmHg,5小時(shí)/天)的減壓低氧處理。通過(guò)酶解法得到單個(gè)心室肌細(xì)胞,并用Fluo3-AM于37℃負(fù)載1小時(shí)。在缺血前、模擬缺血以及復(fù)灌過(guò)程中用激光共聚焦顯微鏡掃描記錄熒光強(qiáng)度及圖像。
　　 結(jié)果:
　　

9、 1正常臺(tái)氏液中,CON和CIHH組心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣無(wú)顯著差異(P＞0.05),在5min模擬缺血和10min再灌注后,CON組心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度增加,而在CIHH28和CIHH42組減弱心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度增加幅度減少,與相應(yīng)CON有顯著差異(P＜0.05)。
　　 2 CIHH28和CIHH42的這一效應(yīng)可被L型鈣通道開(kāi)放劑Bay K8644。肌漿網(wǎng)鈣泵抑制劑thapsigargin和PKC抑制劑chelerythr

10、ine chloride取消。
　　 小結(jié):CIHH可抑制發(fā)育大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的增加,這一效應(yīng)可被Bay K8644,thapsigargin和chelerythrine chloride取消,提示CIHH的心臟保護(hù)效應(yīng)可能與抗鈣超載和PKC激活有關(guān)。
　　 Ⅲ慢性間歇性低壓低氧對(duì)發(fā)育大鼠鈣處理蛋白表達(dá)的影響
　　 目的:用Western blot方法研究CIHH對(duì)發(fā)育大鼠鈣處理蛋白表達(dá)的影響。

11、　　 方法:雄性新生SD大鼠,按年齡及體重相匹配分成四組:28天間歇性低壓低氧組(CIHH28)、42天間歇性低壓低氧組(CIHH42)和28天對(duì)照組(CON28)、42天對(duì)照組(CON42)。CIHH動(dòng)物置于低壓氧艙,分別接受28天和42天模擬高原3000米(PB=525mmHg,Po2=108.8 mmHg,5小時(shí)/天)的減壓低氧處理。組織勻漿后提取肌漿網(wǎng)和肌膜蛋白。用Westernblot方法檢測(cè)I/R時(shí)鈉鈣交換體(NCX1),

12、Ryanodine受體(RyR2)和肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2)蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:基礎(chǔ)狀態(tài)下,各組大鼠心肌NCX1,RyR2和SERCA2蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。在模擬缺血條件下,CON28和CON42大鼠心肌NCX1,RyR2和SERCA2蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05),而CIHH28和CIHH42大鼠心肌的NCX1,RyR2和SERCA2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　 小結(jié):CIHH可

13、對(duì)抗缺血/再灌注對(duì)發(fā)育大鼠心肌NCX1、RyR2和SERCA2蛋白表達(dá)的抑制,而發(fā)揮抗缺血/再灌注鈣超載作用。
　　 Ⅳ慢性間歇性低壓低氧對(duì)發(fā)育大鼠L型鈣電流及鈉鈣交換電流的影響
　　 目的:用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究CIHH對(duì)發(fā)育大鼠L型鈣電流(ICaL)及鈉鈣交換電流(Ina/Ca)的影響,探討CIHH心臟保護(hù)及抗鈣超載的離子機(jī)制。
　　 方法:雄性新生SD大鼠,按年齡及體重相匹配分成四組:28天間歇性低壓低氧組

14、(CIHH28)、42天間歇性低壓低氧組(CIHH42)和28天對(duì)照組(CON28)、42天對(duì)照組(CON42)。CIHH動(dòng)物置于低壓氧艙,分別接受28天和42天模擬高原3000米(PB=525 mmHg,Po2=108.8 mmHg,5小時(shí)/天)的減壓低氧處理。通過(guò)酶解法得到單個(gè)心肌細(xì)胞,利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄及ICaL及Ina/Ca,觀察CIHH對(duì)大鼠心肌細(xì)胞ICaL和Ina/Ca的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1

15、ICaL
　　 1.1在正常細(xì)胞外液中,對(duì)照組和間歇性低氧組的ICaL峰值電流和I-V曲線無(wú)顯著差異(P＞0.05)。模擬缺血和再灌注時(shí),CON28和CON42組心肌細(xì)胞的ICaL峰值電流明顯減少(P＜0.05),I-V曲線向上移位,而CIHH28和CIHH42組心肌細(xì)胞峰值ICaL電流和I-V曲線無(wú)明顯變化(P＞0.05)。
　　 1.2各組心肌細(xì)ICaL的穩(wěn)態(tài)激活、失活后復(fù)活曲線在正常細(xì)胞外液、模擬缺血和再灌注條件下

16、均無(wú)明顯變化(P＞0.05)。在正常細(xì)胞外液中,各組心肌細(xì)胞ICaL的穩(wěn)態(tài)失活曲線無(wú)明顯變化(P＞0.05)。模擬缺血和再灌注時(shí),CON組心肌細(xì)胞ICaL的穩(wěn)態(tài)失活曲線向左移位(P＜0.05),而CIHH組心肌細(xì)肌ICaL的穩(wěn)態(tài)失活曲線無(wú)顯著變化(P＞0.05)。
　　 2 Ina/Ca
　　 2.1正常細(xì)胞外液中,各組心肌細(xì)胞的Ina/Ca無(wú)顯著差異(P＞0.05)。在模擬缺血條件下,CON28和CON42組心肌細(xì)胞L

17、na/Ca,的內(nèi)向電流和外向電流部分均減少(P＜0.05),內(nèi)向電流的抑制比外向電流更明顯。而CIHH28和CIHH42組心肌細(xì)胞Ina/Ca無(wú)顯著變化(P＞0.05)。
　　 2.2模擬缺血條件下,CON28和CON42組心室肌細(xì)胞Ina/Ca反轉(zhuǎn)電位向負(fù)值方向移位(P＜0.05),而CIHH28和CIHH42組心室肌細(xì)胞Ina/Ca反轉(zhuǎn)電位無(wú)顯著變化(P＞0.05)。
　　 小結(jié):CIHH對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)的發(fā)育大鼠心室肌細(xì)