慢性間歇性低壓低氧對代謝綜合征大鼠血管內皮保護作用及機制的研究.pdf

1、隨著現代社會物質生活水平的提高和生活模式的改變,世界范圍肥胖人口的比例在快速升高。世界衛(wèi)生組織(WHO)日前公布，截止到2013年，全世界有超過21億人超重或肥胖，其中美國占全球肥胖者的13％，而我國和印度共同占總數的15％。肥胖及其引發(fā)的相關疾病也越來越受到公眾和社會注意。以肥胖、高血脂、動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病等為組成的代謝綜合征已成為首要危害人民健康的一組疾病。最早期相關血管功能的異常是內皮功能障礙，主要表現為血管對縮血管物質

2、的反應性增加，對舒血管物質的反應性降低。
　　內皮功能障礙的誘發(fā)因素主要包括腎素-血管緊張素系統(tǒng)過度激活、缺氧/復氧損傷、缺血/再灌注損傷、胰島素抵抗、炎癥/免疫反應、氧化應激和內質網應激(endoplasmic reticulumstress，ERS)等。內質網是蛋白質合成、折疊和成熟的主要部位，其內環(huán)境的穩(wěn)定是實現內質網功能的基本條件。ERS是指蛋白質折疊、捕獲和降解的破壞，導致內質網中未折疊蛋白的積累。高脂可引發(fā)肥胖動物內質

3、網中蛋白質合成速度過快以至于超過蛋白質折疊能力，導致未折疊和錯誤折疊蛋白的積累，表現ERS。而ERS又可激活炎癥反應，促進肝臟和脂肪組織的胰島素抵抗，引發(fā)血管內皮功能障礙和動脈粥樣硬化。
　　自噬是一種溶酶體相關的降解蛋白質和回收細胞器的重要細胞過程，與ERS之間存在互為因果的功能性耦合。ERS作為自噬反應的刺激者，為細胞在不利環(huán)境下存活而激活自噬，去除功能失調或損壞的細胞器，減輕ERS以恢復內質網動態(tài)平衡，從而保護生命體。因此，

4、自噬是蛋白質穩(wěn)態(tài)和抗氧化應激的重要機制之一。自噬流指整個自噬的動態(tài)過程，是評價自噬功能的重要指標。自噬體的形成及其在溶酶體內的降解是自噬流的兩大關鍵部分。自噬功能的缺損或障礙，會加重氧化應激和ERS，參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展，包括脂質代謝異常、神經變性、腫瘤、衰老及缺血再灌注損傷等心臟相關疾病。高脂飲食喂養(yǎng)的動物，由于自噬流改變，導致外周組織對胰島素信號轉導障礙和ERS，發(fā)展為肥胖。與之對應的是，肥胖動物的自噬功能障礙，表現為氧化應激、E

5、RS和NO生物利用度受損，減弱內皮細胞抗動脈粥樣硬化的保護功能。
　　自噬接受眾多分子信號途徑調控，其中腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine mono-phosphate activated protein kinase，AMPK)既作為上游能量傳感器，又作為下游自噬活化劑，特別是在糖尿病等內分泌紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。AMPK主要通過抑制mTOR復合物和磷酸化ULK1，觸發(fā)自噬兩個下游信號分子S6K1和4E-BP1，以TSC1

6、/2依賴性或非依賴性機制，在能量平衡和代謝應激中正向調節(jié)自噬。
　　我室以往研究表明，慢性間歇性低壓低氧(chronic intermittent hypobaric hypoxia，CIHH)對機體多種組織具有保護作用。在心臟方面，可促進缺血/再灌注心臟功能的恢復、縮小梗死面積和抗心律失常；在肝臟方面，可降低代謝綜合征大鼠ERS介導的肝臟損傷，改善胰島素抵抗、糖脂代謝紊亂及肝組織脂肪樣變；在血管方面，可通過上調腎血管性高血壓大鼠

7、血管eNOS表達，增加NO產生，增強大鼠動脈內皮依賴性舒張，發(fā)揮抗高血壓作用。此外，CIHH還具有免疫調節(jié)、抗炎和抗氧化等有益作用。據此，我們提出假設：CIHH可明顯改善代謝綜合征肥胖大鼠血管內皮功能障礙及血管舒縮功能紊亂，此作用可能通過增強自噬功能，降低ERS，增加NO產生所實現。
　　本研究擬利用代謝綜合征肥胖大鼠，應用形態(tài)學、生理學以及分子生物學等方法，從整體、組織和細胞不同水平明確CIHH對代謝綜合征肥胖大鼠腸系膜阻力血管

8、內皮和血管舒縮的影響，并探討其機制。
　　本研究分為三部分：
　　(1)通過形態(tài)學、生物化學和微血管張力測定等方法確定CIHH對代謝綜合征肥胖大鼠腸系膜動脈血管內皮和血管舒縮功能的保護作用。
　　(2)通過離體血管培養(yǎng)、微血管張力測定和Western blot等方法探討抗氧化應激和ERS在CIHH血管內皮保護中的作用。
　　(3)通過離體器官培養(yǎng)、微血管張力測定和Western blot等方法探討自噬在CIHH血

9、管內皮保護中的作用。
　　第一部分：慢性間歇性低壓低氧對代謝綜合征大鼠血管內皮和舒縮功能的保護作用
　　目的：
　　明確CIHH對代謝綜合征大鼠血管內皮和血管舒縮功能障礙的保護作用。
　　方法：
　　成年雄性Sprague-Dawlay大鼠隨機分為四組：對照組(CON)、慢性間歇性低壓低氧處理組(CIHH)、代謝綜合征模型組(MS)、代謝綜合征模型+慢性間歇性低壓低氧處理組(MS+CIHH)。CON大鼠和C

10、IHH大鼠給予常規(guī)飼料和普通飲用水喂養(yǎng)。MS大鼠和MS+CIHH大鼠給予高脂飼料加10％果糖水喂養(yǎng)誘導MS。16周后，CIHH和MS+CIHH大鼠接受相當于海拔5000m高度、28天、每天6小時的低壓低氧處理，其余時間置于常氧環(huán)境。CON和MS大鼠始終置于常氧環(huán)境。CIHH處理期間，每周固定時間測定大鼠體重和動脈收縮壓變化。28天CIHH處理完畢后，測量大鼠身長、體重和體脂，計算Lee's指數和脂肪系數；掃描電鏡下觀察腸系膜血管周圍脂肪

11、細胞的大??；取靜脈血測定血液生化指標(空腹葡萄糖、胰島素、C肽、脂類)、炎癥因子(白細胞介素-1β、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α)、粘附分子(細胞間粘附分子-1和血管細胞粘附分子-1)、NO和內皮素-1(ET-1)；利用微血管環(huán)張力測定法分別描記苯腎上腺素(PE)和去甲腎上腺素(NE)誘導的動脈環(huán)收縮反應，乙酰膽堿(ACh)誘導的動脈環(huán)內皮依賴性舒張(EDR)和硝普鈉(SNP)誘導的動脈環(huán)非內皮依賴性舒張。
　　結果：

12、　　1.與CON大鼠相比較，MS大鼠動脈收縮壓和體重顯著增加(P<0.05)；CIHH處理對正常大鼠基礎動脈收縮壓和體重無影響(P>0.05)，但可顯著對抗MS大鼠動脈收縮壓的升高和體重的增加(P<0.05)。
　　2.與CON大鼠相比較，MS大鼠Lee's指數、脂肪系數和腸系膜血管周圍脂肪細胞直徑明顯增加；CIHH處理對正常大鼠Lee's指數、脂肪系數和腸系膜血管周圍脂肪細胞的大小無影響(P>0.05)，但可顯著對抗MS大鼠的肥

13、胖表征和脂肪細胞增生(P<0.05-0.01)。
　　3.與CON大鼠相比較，MS大鼠表現明顯的糖、脂代謝紊亂和胰島素抵抗(P<0.05)；CIHH處理對正常大鼠代謝無明顯影響(P>0.05)，但可顯著對抗MS大鼠的糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗(P<0.05-0.01)。
　　4.與CON大鼠相比較，MS大鼠表現炎癥因子、粘附分子升高和NO與ET-1失衡(P<0.05-0.01)；CIHH處理對正常大鼠炎癥因子、粘附分子和NO與

14、ET-1平衡無影響(P>0.05)，但可顯著對抗MS大鼠的炎癥因子、粘附分子升高和NO與ET-1失衡(P<0.05-0.01)。
　　5.與CON大鼠相比較，MS大鼠腸系膜動脈環(huán)對PE和NE反應性明顯升高，收縮增強(P<0.01)；CIHH處理降低大鼠腸系膜動脈環(huán)對PE和NE收縮反應性，減弱收縮(P<0.05-0.01)，并對抗MS大鼠動脈環(huán)收縮的增強(P<0.01)。
　　6.與CON大鼠相比較，MS大鼠腸系膜動脈EDR顯

15、著降低(P<0.01)；CIHH處理明顯增強腸系膜動脈EDR(P<0.01)，并對抗MS大鼠腸系膜動脈EDR的降低(P<0.01)。
　　7.與CON大鼠相比較，MS大鼠腸系膜動脈非內皮依賴性舒張明顯降低(P<0.05)；CIHH處理可增加大鼠腸系膜動脈非內皮依賴性舒張(P<0.01)，并對抗MS大鼠腸系膜動脈非內皮依賴性舒張的降低(P<0.01)。
　　小結：
　　本部分研究結果表明，高脂高果糖飲食誘導的肥胖MS大鼠

16、存在明顯的糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗，動脈收縮壓升高，內皮功能損傷以及血管舒縮功能紊亂；CIHH處理可能通過降低胰島素抵抗，減輕炎癥，增加NO產生，從而減輕MS大鼠糖脂代謝紊亂、增強血管內皮功能和改善血管舒縮功能異常。
　　第二部分：慢性間歇性低壓低氧通過抑制內質網應激改善代謝綜合征大鼠腸系膜動脈內皮依賴性舒張
　　目的：
　　探討氧化應激和內質網應激在CIHH對代謝綜合征大鼠腸系膜動脈內皮依賴性舒張改善中的作用及其機制

17、。
　　方法：
　　成年雄性Sprague-Dawlay大鼠隨機分為四組：對照組(CON)、慢性間歇性低壓低氧處理組(CIHH)、代謝綜合征模型組(MS)、代謝綜合征模型+慢性間歇性低壓低氧處理組(MS+CIHH)。CON大鼠和CIHH大鼠給予常規(guī)飼料和普通飲用水喂養(yǎng)。MS大鼠和MS+CIHH大鼠給予高脂飼料加10％果糖水喂養(yǎng)誘導MS。16周后，CIHH和MS+CIHH大鼠接受相當于海拔5000m高度、28天、每天6小時的低

18、壓低氧處理，其余時間置于常氧環(huán)境。CON和MS大鼠始終置于常氧環(huán)境。應用微血管環(huán)張力測定法，觀測 NO合酶抑制劑 L-NAME、超氧陰離子清除劑4-Hydroxy-TEMPO和ERS抑制劑4-苯基丁酸(PBA)對EDR的影響；應用Western blot方法觀測CIHH對腸系膜動脈eNOS磷酸化蛋白表達，以及ERS相關蛋白表達的影響；利用離體器官培養(yǎng)、微血管環(huán)張力測定法和Western blot方法，觀察ERS誘導劑衣霉素(Tu)和抑制

19、劑PBA對CIHH處理MS大鼠腸系膜動脈EDR、eNOS磷酸化水平和ERS相關蛋白表達的影響。
　　結果：
　　1.與CON大鼠相比較，L-NAME對MS大鼠動脈環(huán)EDR抑制作用顯著降低(P<0.01)，對CIHH大鼠動脈環(huán)EDR抑制作用顯著增強(P<0.01)，可有效對抗MS大鼠對L-NAME抑制效應的降低(P<0.01)。
　　2.與CON大鼠相比，4-Hydroxy-TEMPO對MS大鼠動脈環(huán)EDR的增強作用顯著

20、增加(P<0.01)，對CIHH大鼠動脈環(huán)EDR的增強作用明顯降低(P<0.01)，可有效對抗MS大鼠對4-Hydroxy-TEMPO增強作用的增加(P<0.05)。
　　3.與CON大鼠相比，PBA對MS大鼠動脈環(huán)EDR的增強效應顯著增加(P<0.01)。對CIHH大鼠動脈環(huán)EDR增強效應無顯著性差異(P>0.05)。與MS大鼠相比較， PBA對MS+CIHH大鼠動脈環(huán)EDR增強效應顯著降低(P<0.01)。
　　4.與C

21、ON大鼠相比較，MS大鼠腸系膜動脈eNOS(Ser1177)磷酸化明顯降低(P<0.01)， CIHH大鼠腸系膜動脈eNOS(Ser1177)磷酸化無顯著差異(P>0.05)，但可有效對抗MS大鼠腸系膜動脈eNOS(Ser1177)磷酸化的降低(P<0.01)。
　　5.與CON大鼠相比較， MS大鼠腸系膜動脈ERS相關蛋白GRP78和CHOP表達明顯上調(P<0.01)，CIHH大鼠腸系膜動脈GRP78和CHOP表達無顯著差異(

22、P>0.05)，但可有效對抗MS大鼠GRP78和CHOP表達的上調(P<0.05-0.01)。
　　6.ERS誘導劑Tu可顯著抑制MS+CIHH大鼠動脈環(huán)ACh誘發(fā)的EDR(P<0.01)，而ERS抑制劑PBA可顯著增加MS+CIHH動脈環(huán)ACh誘發(fā)的EDR(P<0.01)。
　　7.ERS誘導劑Tu顯著增加MS+CIHH大鼠動脈環(huán)GRP78和CHOP蛋白表達(P<0.05-0.01)，下調eNOS(Ser1177)磷酸化(

23、P<0.01)；而ERS抑制劑PBA顯著降低MS+CIHH大鼠動脈環(huán)GRP78和CHOP蛋白表達(P<0.05-0.01)，上調eNOS(Ser1177)磷酸化(P<0.01)。
　　小結：
　　本部分研究結果表明，高脂高果糖飲食誘導的肥胖MS大鼠腸系膜動脈存在明顯的氧化應激和ERS，通過降低eNOS磷酸化，導致NO生成減少、血管舒張功能障礙；CIHH可通過降低氧化應激和ERS，增強eNOS磷酸化，增加NO產生，從而改善內皮

24、功能障礙和增強血管舒張功能。
　　第三部分：慢性間歇性低壓低氧通過增強自噬改善代謝綜合征大鼠腸系膜動脈內皮依賴性舒張
　　目的：
　　探討自噬在CIHH對代謝綜合征大鼠腸系膜動脈內皮依賴性舒張改善中的作用及其機制。
　　方法：
　　成年雄性Sprague-Dawlay大鼠隨機分為四組：對照組(CON)、慢性間歇性低壓低氧處理組(CIHH)、代謝綜合征模型組(MS)和代謝綜合征模型+慢性間歇性低壓低氧處理組(

25、MS+CIHH)。CON和CIHH大鼠給予常規(guī)飼料和普通飲用水喂養(yǎng)。MS大鼠和MS+CIHH大鼠給予高脂飼料加10％果糖水喂養(yǎng)誘導MS。16周后，CIHH大鼠和MS+CIHH大鼠接受相當于海拔5000m高度、28天、每天6小時的低壓低氧處理，其余時間置于常氧環(huán)境。CON大鼠和MS大鼠始終置于常氧環(huán)境。利用Western blot方法，觀察自噬相關蛋白、AMPK磷酸化和mTOR磷酸化；利用離體器官培養(yǎng)、微血管環(huán)張力測定法和Western

26、blot方法，分別觀察ERS誘導劑Tu和抑制劑PBA、自噬誘導劑雷帕霉素(RAPA)和抑制劑3甲基腺嘌呤(3MA)、AMPKα抑制劑復合物C(Com C)和mTOR抑制劑RAPA對大鼠腸系膜動脈EDR及相應蛋白表達的影響；利用離體器官培養(yǎng)、透射電子顯微鏡和Western blot方法，檢測自噬降解阻斷劑氯喹(CQ，即溶酶體抑制劑)對自噬流的影響。
　　結果：
　　1.ERS誘導劑Tu顯著增加MS+CIHH動脈環(huán)自噬相關蛋白B

27、eclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達(P<0.01)，而ERS抑制劑PBA顯著降低Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(P<0.05-0.01)。
　　2.自噬誘導劑RAPA顯著增加 MS+CIHH動脈環(huán) ACh誘導的EDR(P<0.01)，而自噬抑制劑3MA顯著抑制MS+CIHH動脈環(huán)ACh誘導的EDR(P<0.01)。
　　3.自噬誘導劑RAPA顯著增加 MS+CIHH動脈環(huán)自噬相關蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ/

28、Ⅰ的表達(P<0.01)，降低ERS相關蛋白GRP78和CHOP的表達(P<0.01)，上調eNOS(Ser1177)磷酸化(P<0.05)；而自噬抑制劑3MA顯著降低MS+CIHH動脈環(huán)Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(P<0.05)，增加GRP78和CHOP蛋白表達(P<0.05-0.01)，下調eNOS(Ser1177)磷酸化(P<0.01)。
　　4.與CON大鼠相比較，MS大鼠腸系膜動脈自噬相關蛋白Beclin-

29、1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達均明顯上調(P<0.05-0.01)。與MS大鼠相比較， MS+CIHH大鼠腸系膜動脈Beclin-1、LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62表達均明顯降低(P<0.05)。
　　5.自噬降解阻斷劑CQ可增加各組大鼠腸系膜動脈自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/Ⅰ和p62的表達，其中CIHH大鼠蛋白升高最大(P<0.05-0.01)，MS大鼠蛋白升高最小(P<0.05-0.01)。
　　6.與CON大鼠相比較，MS大鼠腸系

30、膜動脈AMPK(Thr172)磷酸化明顯下調，mTOR(Ser2448)磷酸化明顯上調(P<0.01)。與MS大鼠相比較，MS+CIHH大鼠腸系膜動脈的AMPK(Thr172)磷酸化明顯上調，mTOR(Ser2448)磷酸化明顯下調(P<0.01)。
　　7.AMPKα抑制劑Com C可顯著抑制MS+CIHH大鼠腸系膜動脈的EDR(P<0.01)，而mTOR抑制劑RAPA可顯著增加MS+CIHH大鼠腸系膜動脈EDR(P<0.01)

31、。
　　8.AMPKα抑制劑Com C可顯著降低MS+CIHH大鼠腸系膜動脈的AMPK(Thr172)磷酸化(P<0.01)，增加mTOR(Ser2448)磷酸化(P<0.01)，降低Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(P<0.05-0.01)，升高GRP78和CHOP蛋白表達(P<0.01)，下調eNOS(Ser1177)磷酸化(P<0.01)；而mTOR抑制劑RAPA增加MS+CIHH大鼠腸系膜動脈的AMPK(Thr17

32、2)磷酸化(P<0.01)，降低mTOR(Ser2448)磷酸化(P<0.01)，增加Beclin-1和LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(P<0.01)，降低GRP78和CHOP蛋白表達(P<0.05-0.01)，上調eNOS(Ser1177)磷酸化(P<0.01)。
　　小結：
　　本部分研究結果表明，高脂高果糖飲食誘導的肥胖MS大鼠腸系膜動脈AMPK-mTOR信號通路活性降低、自噬流降解途徑障礙、ERS介導的自噬相關蛋白表達增強、

33、eNOS磷酸化下調、內皮功能受損和EDR反應降低；CIHH通過激活MS大鼠腸系膜動脈AMPK-mTOR信號通路，改善自噬流的功能，降低ERS，促進eNOS磷酸化，增加NO產生，從而保護血管內皮和增強EDR反應。
　　結論：
　　高脂高果糖飲食誘導的肥胖代謝綜合征大鼠呈現明顯的糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、炎癥和氧化應激，腸系膜動脈ERS和自噬功能障礙、血管內皮功能損傷和舒縮功能紊亂。
　　CIHH處理對代謝綜合征大鼠腸系膜