豬骨骼肌特異性表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、為提高轉(zhuǎn)基因豬的生產(chǎn)水平，使外源基因能夠在豬骨骼肌特異高效地表達(dá)，必須構(gòu)建一個(gè)特異高效表達(dá)的表達(dá)載體，其中啟動(dòng)子的選擇非常重要。我們首先改造了無啟動(dòng)子的紅色熒光蛋白載體，添加了增強(qiáng)子，IRES等元件以滿足分析需要，然后分析豬α actin，CKM，CAPN 3、CA 3、TNNI 2、CASQ 1、GEM等7種骨骼肌特異性表達(dá)基因5′調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，確定需要克隆的區(qū)間，經(jīng)PCR獲得目的啟動(dòng)子片段，酶切連入無啟動(dòng)子的報(bào)告基因載體

2、中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染成肌細(xì)胞并誘導(dǎo)分化，同時(shí)轉(zhuǎn)染其他組織來源的細(xì)胞為對照，包括心肌細(xì)胞，腎細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，肝細(xì)胞。本研究結(jié)果如下：
　　 ⑴Α actin，CKM，CAPN 3的啟動(dòng)子僅在誘導(dǎo)分化的肌細(xì)胞中有啟動(dòng)活性，在其他來源的細(xì)胞中無啟動(dòng)活性。
　　 ⑵其他豬骨骼肌特異性基因的啟動(dòng)子在骨骼肌中未檢測到啟動(dòng)活性，在其他組織來源的細(xì)胞中也未檢測到啟動(dòng)活性。
　　 ⑶GEM啟動(dòng)子在多種組織來源的細(xì)胞中均有啟動(dòng)活

3、性。
　　 ⑷得到三種豬骨骼肌特異性表達(dá)載體：CMV Enhancer-α actinPromoter-pIRES-DsRed，CMV Enhancer-CKM Promoter-pIRES-DsRed，CMV Enhancer-CAPN3 Promoter-pIRES-DsRed。
　　 ⑸得到了一種廣泛性表達(dá)的啟動(dòng)子：CMV Enhancer-CKM Promoter-pIRES-DsRed。骨骼肌特異性表達(dá)載體僅在