球孢白僵菌硫醇-二硫化物氧化還原酶系和兩個(gè)內(nèi)吞標(biāo)志位點(diǎn)蛋白的功能解析.pdf

1、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是經(jīng)典的絲狀昆蟲病原真菌，被廣泛用于農(nóng)林害蟲的生物防治?；谇蜴甙捉┚闹苿┰谔镩g應(yīng)用中常遭受高溫、陽(yáng)光紫外輻射、化學(xué)農(nóng)藥等環(huán)境因子的脅迫制約，影響其生物防治潛能的發(fā)揮。除了環(huán)境脅迫因子，生防真菌在進(jìn)入昆蟲體內(nèi)后還會(huì)遭遇到由寄主細(xì)胞免疫應(yīng)答所引起的脅迫。因此，開展白僵菌抗逆生物學(xué)研究，揭示抗逆性狀的分子基礎(chǔ)及其對(duì)生防潛能的影響，是合理應(yīng)用生防真菌制劑防治農(nóng)林害蟲的科學(xué)依據(jù)。在田間環(huán)境及宿

2、主體內(nèi)雙重脅迫作用下，真菌細(xì)胞不可避免地被活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)損傷。谷氧還蛋白-谷胱甘肽氧化還原酶系(Glutaredoxin-Glutathione Reductase，GRX-GLR)及硫氧還蛋白氧化還原酶系(Thioredoxin-Thioredoxin Reductase，TRX-TRR)是真菌及其重要的抗氧化機(jī)制，是抵御ROS損傷含硫生物大分子的主要屏障。然而,這兩大抗氧化酶系

3、在昆蟲病原性絲狀真菌中的生物學(xué)功能目前知之不多。因此，研究這兩大酶系內(nèi)部的相互作用及其與超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過(guò)氧化氧酶(Catalase，CAT)、過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD)及抗氧化小分子谷胱甘肽(Glutathione，GSH)之間的互作關(guān)系,對(duì)于理解GRX-GLR及TRX-TRR保護(hù)真菌細(xì)胞的作用和機(jī)理，進(jìn)而明確它們對(duì)真菌生防潛能的貢獻(xiàn)，具有重要的意義。此外，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)

4、對(duì)于維持細(xì)胞存活狀態(tài)及正常功能發(fā)揮具有決定性作用。內(nèi)吞標(biāo)志性位點(diǎn)(eisosome)作為重要的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)域，具有穩(wěn)定細(xì)胞構(gòu)象、應(yīng)答及傳遞胞內(nèi)外環(huán)境信號(hào)、攝取營(yíng)養(yǎng)元素等重要作用。 Pil1和Lsp1是兩個(gè)主要的組裝蛋白，參與內(nèi)吞標(biāo)志性位點(diǎn)的構(gòu)建。因此，本研究包含三個(gè)方面的工作，一是研究GRX-GLR酶系抗逆生物學(xué)功能及其對(duì)毒力的貢獻(xiàn)，二是解析TRX-TRR酶系功能及其可能的互作關(guān)系，三是就Pil1/Lsp1的細(xì)胞自噬調(diào)控作用及其生防潛能影

5、響開展了較詳盡的研究。主要研究?jī)?nèi)容及成果分述如下:
　　球孢白僵菌GRX-GLR酶系的抗氧化功能解析谷氧還蛋白酶(Grx)是負(fù)責(zé)調(diào)控胞內(nèi)硫醇-二硫化物氧化還原的一類蛋白，與硫氧還蛋白酶系具有重疊且又有所區(qū)分的生物學(xué)功能。球孢白僵菌擁有五個(gè)GRX家族成員(Grx1-5)和一個(gè)谷胱甘肽還原酶(Glr)。根據(jù)保守位點(diǎn)的不同，五個(gè)GRX成員可分為三類，即二硫醇谷氧還蛋白Grx1(保守活性位點(diǎn)為CPY/FC)，單硫醇谷氧還蛋白Grx2-4(

6、活性位點(diǎn)為CGFS或CS/PYS)以及類似谷氧還蛋白的蛋白Grx5(活性位點(diǎn)為CPDC)。grx或glr的單基因缺失,在正常條件下一般可通過(guò)其余同伴基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)而得到補(bǔ)償。最特別的是grx3，它的轉(zhuǎn)錄上調(diào)可補(bǔ)償氧化脅迫條件下grx1、grx2、grx5或glr的缺失，而它自身的缺失在正常條件下只能靠不可敲除的grx4的轉(zhuǎn)錄上調(diào)而得到補(bǔ)償，或是靠其余同伴基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)而應(yīng)對(duì)甲萘醌的氧化脅迫。結(jié)果是細(xì)胞氧化還原狀態(tài)受干擾的程度以△glr為

7、甚，其次是△grx3，但在其余grx敲除株中受干擾不明顯。正常培養(yǎng)條件下的SOD總酶活是△grx1-3敲除株顯著高于野生株，但在甲萘醌脅迫下SOD總酶活是△grx5和△glr敲除株顯著低于野生株。不管有無(wú)過(guò)氧化氫脅迫，各敲除株的CAT總酶活都有不同程度的上升，而POD總酶活在△glr中的下降幅度大于△grx3。在脅迫應(yīng)答中，△grx3僅對(duì)上述兩種氧化劑敏感性有所上升，△glr不僅對(duì)上述兩種氧化劑而且對(duì)硫醇氧化劑和硫醇還原劑的敏感性都有所

8、上升。有趣的是，所有敲除株都對(duì)Fe3+更敏感，并伴隨兩個(gè)Fe3+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)。生防潛能相關(guān)表型在除△grx5之外的敲除株中都或多或少地有所改變。敲除株的所有變化都在回補(bǔ)株中懨復(fù)到野生株的水平。結(jié)果表明，在球孢白僵菌依賴于Glr的氧還系統(tǒng)與SOD、CAT、GSH-POD抗氧化酶系的互作關(guān)系，Grx3在系統(tǒng)中扮演著比其余同伴更為關(guān)鍵的角色。
　　球孢白僵菌硫氧還蛋白的功能解析硫氧還蛋白(Trx)具有還原硫化物、為二硫化物的還

9、原過(guò)程提供電子等功能。通過(guò)這一還原功能,Trx能夠保護(hù)細(xì)胞免受ROS的損傷。球孢白僵菌擁有比其他真菌更多的硫氧還蛋白家族成員(Trx1-6)。通過(guò)在野生菌株中表達(dá)融合蛋白Trxx::eGFP(x=1，2，…，6）并對(duì)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞進(jìn)行特異性染色分析，證明Trx1-4、Trx5及Trx6分別定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核膜及線粒體中。各Trx的單基因敲除導(dǎo)致其他家族成員的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，說(shuō)明六個(gè)家族成員之間至少存在轉(zhuǎn)錄水平上的互補(bǔ)效應(yīng)。與野生株相比，

10、只有△trx2對(duì)甲萘醌的敏感性顯著上升，而包括△trx2在內(nèi)的所有trx敲除株對(duì)H2O2的響應(yīng)都無(wú)變化。有趣的是，將trx敲除株與甲萘醌共培養(yǎng)，SOD總酶活僅在△trx2中表現(xiàn)劇烈下降。與此同時(shí)，菌絲細(xì)胞內(nèi)還原/氧化型谷胱甘肽比率在△trx2中僅有0.4,而在包括野生菌在內(nèi)的其他受試菌株中比值維持在1.0上下。除此之外，產(chǎn)孢、萌發(fā)、耐熱、耐紫外以及毒力等生防潛能相關(guān)性狀在所有敲除突變株中都有或多或少的改變。
　　兩個(gè)硫氧還蛋白還原

11、酶(Trr1/2)的功能解析及其作用的Trx成員硫氧還蛋白還原酶Trr通過(guò)招募還原性輔酶NADPH使其自身獲得將氧化型Trx還原的能力，并與之組成硫氧還蛋白氧還酶系統(tǒng)。在酵母細(xì)胞中,Trx與Trr根據(jù)亞細(xì)胞定位分區(qū)而自然配對(duì)。但球孢白僵菌擁有都定位于細(xì)胞質(zhì)的Trr1和Trr2同源蛋白，但各自與六個(gè)Trx成員之間的靶向關(guān)系不明。雖然trr2缺失導(dǎo)致部分trx基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，但trr1缺失引起更多trx基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)且幅度更大，而且僅有trr

12、1的缺失時(shí)才誘發(fā)半胱氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷、Trx總活力上升、POD及SOD總酶活下降等重要變化。有趣的是，在△trr1中超表達(dá)trx1、trx6或trr1時(shí)，上述表型缺陷被完全回復(fù)，而超表達(dá)trx2/3/4/5或trr2都無(wú)法挽救細(xì)胞的上述缺陷。這些結(jié)果意味著，Trr1可能通過(guò)還原Trx2-5而在白僵菌硫氧還蛋白氧還系統(tǒng)中發(fā)揮著主導(dǎo)作用,Trr2可能還原Trx1和Trx6而起著系統(tǒng)備份的作用。
　　兩個(gè)內(nèi)吞標(biāo)志位點(diǎn)蛋白(Pil1與Lsp1

13、)對(duì)球孢白僵菌的細(xì)胞自噬與生防潛能的調(diào)控作用細(xì)胞膜在細(xì)胞生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)攝取以及胞內(nèi)外信號(hào)接收、傳遞等方面起著舉足輕重的作用。內(nèi)吞標(biāo)志位點(diǎn)(eisosome)是定位于質(zhì)膜且標(biāo)有內(nèi)吞位點(diǎn)的大型雜合蛋白復(fù)合體，能夠容納脂質(zhì)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、信號(hào)分子等，因而是細(xì)胞膜正常行使功能所必不可少的。球孢白僵菌的內(nèi)吞標(biāo)志位點(diǎn)中有Pil1及Lsp1兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白，均定位于膜下側(cè)的細(xì)胞周質(zhì)，且呈不連續(xù)的斑點(diǎn)狀。盡管二者共同定位在內(nèi)吞位點(diǎn)的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域上，但各自的定位

14、不需互為前提，這明顯區(qū)別于釀酒酵母中Pil1的正確定位是Lsp1定位在結(jié)構(gòu)域上進(jìn)行組裝所必須的。在白僵菌中，pil1的缺失能刺激細(xì)胞自噬，導(dǎo)致囊泡中的自噬體顯著增大，而lsp1的缺失卻完全抑制細(xì)胞自噬發(fā)生，導(dǎo)致在囊泡中無(wú)法形成自噬體。這些觀察與21個(gè)自噬基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平基本一致，即在△pil1表現(xiàn)為全面上調(diào)，而在△lsp1中絕大多數(shù)自噬基因的表達(dá)卻大幅下調(diào)，尤以自噬前體形成最密切的atg8在△lsp1中下調(diào)幅度最大。顯然，Pil1和L

15、sp1具有直接或間接調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子繼而調(diào)控細(xì)胞自噬體形成及狀態(tài)的功能,分別起著負(fù)向和正向調(diào)控細(xì)胞自噬的作用。作為膜結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白，pil1和lsp1的缺失還引發(fā)細(xì)胞對(duì)多種脅迫應(yīng)答的顯著相反變化。有趣的是，所有這些變化在雙敲除菌株中都表現(xiàn)為朝野生株方向回復(fù)的趨勢(shì)。此外，二者的單基因敲除株和雙敲除株的產(chǎn)孢能力、孢子活力、耐高溫及抗紫外輻射等生防潛能相關(guān)性狀，都發(fā)生顯著不同的變化，侵染昆蟲的能力則嚴(yán)重受損，尤以雙敲除株受損最嚴(yán)重。結(jié)果表明，Pil