獼猴桃脂氧合酶基因家族的功能解析及其調(diào)控.pdf

1、以美味獼猴桃(Actinidia deliciosa)果實(shí)為試材，開展了LOX基因家族成員克隆，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，建立了基于LOX基因家族成員表達(dá)的QPCR技術(shù)體系，研究各成員在不同器官、果實(shí)生長發(fā)育和成熟衰老進(jìn)程中的表達(dá)模式，以及不同處理(溫度和乙烯)對LOX基因的表達(dá)調(diào)控，鑒別了獼猴桃果實(shí)后熟軟化和香氣形成相關(guān)家族成員。主要結(jié)果如下： 1、利用獼猴桃EST庫及相關(guān)生物信息學(xué)手段，克隆了LOX基因家族成員6個(gè)，命名為A

2、dLox1、AdLox2、AdLox3、AdLox4、AdLox5和AtLox6，編碼區(qū)長度分別為2739、2595、2739、2709、1359和1557 bp，其中，AdLox1、AdLox2、AdLox3和AdLox4為全長cDNA序列。獼猴桃LOX基因家族成員的序列同源性存在差異，AdLox2和AdLox5氨基酸序列同源性最高，約74％，而AdLox3和AdLox5僅為49％。生物信息學(xué)分析表明，AdLox1、AdLox3、Ad

3、Lox4和AdLox6可能具有13-LOX活性，而AdLox2和AdLox5則屬于9-LOX類型，它們均具有保守的38個(gè)氨基酸殘基，但13-LOX在N端含有額外約60個(gè)氨基酸殘基。獼猴桃AdLox1與番茄TomLoxD具有最高氨基酸序列同源性(80％)，AdLox2和AdLox5與TomLoxA高度聚類，序列同源性分別為68和75％，AdLox4和AdLox6與TomLoxC的氨基酸序列同源性分別為62和63％，AdLox3與其它植物L(fēng)

4、OX序列同源性低于55％。 2、完善并建立了基于LOX基因家族成員功能研究的QPCR技術(shù)體系，該體系具有良好穩(wěn)定性和重復(fù)性，針對基因家族成員序列差異設(shè)計(jì)的特異性引物，有效地避免了交叉擴(kuò)增污染，提高了基因表達(dá)檢測的準(zhǔn)確性。 3、獼猴桃AdLox1在根、莖和花中表達(dá)水平接近；AdLox2轉(zhuǎn)錄本主要在根、莖和葉中積累，且水平相近；AdLox3、AdLox4和AdLox6表達(dá)分布類似，主要存在于莖和葉；AdLox5在根中具有較高

5、表達(dá)水平，但絕對轉(zhuǎn)錄本很低。果實(shí)生長發(fā)育進(jìn)程中，AdLox1、AdLox2、AdLox3和AdLox6具有相似的表達(dá)模式，其轉(zhuǎn)錄本水平從20至80 daa呈下降趨勢，在100 daa則略微增強(qiáng)，然后再次下降直至果實(shí)采收；AdLox4的表達(dá)水平在果實(shí)發(fā)育進(jìn)程中則維持基本穩(wěn)定，但轉(zhuǎn)錄本水平較高；AdLox5表達(dá)水平很低。 4、20℃下獼猴桃果實(shí)成熟衰老進(jìn)程中，ddLox1和.ddLox5表達(dá)隨乙烯積累呈增加趨勢，而AdLox2、.A

6、dLox3、AdLox4和.AdLox6轉(zhuǎn)錄本在果實(shí)后熟軟化過程中趨于下降。外源乙烯處理(100μl/L，20℃，24 h)顯著加速果實(shí)后熟軟化進(jìn)程，誘導(dǎo)L,OX活性上升和MDA含量增加，促進(jìn)了AdLox1和AdLox5表達(dá)水平增強(qiáng)，而AdLox2，AdLox3，AdLox4和AdLox6的轉(zhuǎn)錄本則被明顯抑制，在處理24 h內(nèi)分別下降了5、20、10和2倍。煙草葉片的瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果表明，AdLox1顯著加快葉綠素降解(P<0.05)，促進(jìn)

7、葉綠素?zé)晒庀陆?P<0.05)，誘導(dǎo)組織衰老，而AdLox2則與野生型對照植株無顯著差異。 5、0℃低溫處理168 h，獼猴桃果實(shí)硬度和TSS維持穩(wěn)定水平，轉(zhuǎn)入20℃貨架期貯藏后，成熟進(jìn)程顯著加快。0 ℃貯藏過程AdLox1、AdLox5和AdLox6表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)并72 h左右達(dá)到高峰，隨后下降，這一趨勢與LOX活性變化相吻合。AdLox2、AdLox3和AdLox4轉(zhuǎn)錄本水平在低溫貯藏期間維持穩(wěn)定。 6、LOX活性

8、在獼猴桃果實(shí)成熟進(jìn)程中呈峰型變化(約180 h出現(xiàn)高峰)，伴隨有己醛和(E)-2-己烯醛含量減少。至20℃貯藏276 h，果實(shí)(E)-2-己烯醛水平比180 h時(shí)下降了約7倍。LOX基因家族.AdLox2、AdLox3、AdLox4和AdLox6的表達(dá)趨勢與獼猴桃果實(shí)香氣物質(zhì)變化相一致。果實(shí)圓片組織的離體試驗(yàn)表明，1.0mmol/L LA和1.0 mmol/L LeA處理顯著促進(jìn)LOX活性(P<0.05)，誘導(dǎo)AdLox4和AdLox6