高糖對腎臟細胞因子分泌的影響及纈沙坦的干預(yù)作用研究.pdf

1、研究背景：糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的嚴重并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎?。╡nd stage renal disease,ESRD）的主要原因，主要以系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白和腎小管基底膜的過度積累引起的腎小球系膜增生、蛋白尿以及進行性腎功能不全為特點，并最終進展成為腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化。高血糖對腎臟細胞有明顯的損傷作用。在不同腎

2、臟細胞中，高糖可激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激細胞因子的產(chǎn)生。體外和體內(nèi)研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)在DN以及腎小球硬化癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Ang II是腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的主要效應(yīng)分子，在高糖所致的腎臟損害中起到重要作用。纈沙坦(Valsartan,Val)作為AT1受體拮抗劑，目前已經(jīng)成為治療DN的一線藥物。本研究通過離體灌流腎臟(is

3、olated perfusedkidney，IPK)模型和體外細胞培養(yǎng)方法，探索研究高糖和纈沙坦對TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三種細胞因子表達的影響及其表達的先后順序，為DN的發(fā)生機制提供理論依據(jù)。
　　 實驗方法：本實驗采用離體灌流腎臟和系膜細胞兩種模型，分別觀察高糖(30.0mmol/L)和纈沙坦(lO-6mol/L)在0.5h,lh，2h，4h和6h時對TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三種細胞因子表達的影響

4、。
　　 第一部分高糖對離體大鼠腎臟灌流時細胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 將離體腎臟置于37℃恒溫浴槽里持續(xù)灌流，灌流液分為對照組(葡萄糖lO.Ommo/L)，高糖組（葡萄糖30.Ommol/L）和纈沙坦組(葡萄糖30.0rnmol/L+纈沙坦10-6mol/L)。灌流壓80mmHg，灌流量10ml/min，搜集灌流開始后0.5h，1h,2h,4h和6h時的尿液并記錄尿量。
　　 1.高糖對大鼠IPK腎功

5、能的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 灌流結(jié)束后，取腎組織進行常規(guī)石蠟切片，HE染色，觀察腎臟組織形態(tài)。采用試劑盒測定尿液樣本中的肌苷、LDH以及鉀離子濃度指標。
　　 2.高糖對大鼠IPK細胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用：腎組織切片采用免疫組織化學(xué)染色法觀察高糖和纈沙坦對TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三種細胞因子表達的影響。
　　 第二部分高糖對大鼠系膜細胞細胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 取

6、對數(shù)生長期系膜細胞，消化后按lxl04/ml/孔接種于24孔板，將滅菌的蓋玻片放入培養(yǎng)板的孔內(nèi)，賴氨酸包被后，使細胞爬片。常規(guī)培養(yǎng)24h后，換無血清培養(yǎng)24h，使細胞同步于Go期，分為：對照組(葡萄糖10.0mml/L)，高糖組(葡萄糖30.0mmol/L)和纈沙坦組(葡萄糖30.0mmol/L+纈沙坦10-6mo/L)。分別于培養(yǎng)0.5h，lh，2h，4h和6h后，采用免疫細胞化學(xué)染色法觀察高糖和纈沙坦對體外培養(yǎng)的系膜細胞中TGF-β

7、1、VEGF和PDGF-BB三種細胞因子的表達。采用ELISA法觀察高糖和纈沙坦對體外培養(yǎng)的系膜細胞中TCF-β1的含量。
　　 采用RT-PCR法觀察高糖和纈沙坦對體外培養(yǎng)的系膜細胞中TGF-β1、VEGF和PDGF-BB三種細胞因子mRNA表達的影響。
　　 實驗結(jié)果：
　　 第一部分高糖對離體大鼠腎臟灌流時細胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 1.高糖對大鼠IPK腎功能的影響及纈沙坦的干預(yù)作用

8、r>　　 1.1腎組織形態(tài)學(xué)觀察：高糖組中，腎組織形態(tài)受損情況較對照組嚴重，隨著灌流時間的延長，受損情況加重；纈沙坦組中，腎組織受損情況較高糖組有所改善。
　　 1.2腎功能檢測指標測定：對照組中，隨著灌流時間的延長，尿量、尿液中肌苷、LDH以及鉀離子濃度值均有所降低；高糖組中，與對照組比較，尿量、尿液中肌苷、LDH以及鉀離子濃度值降低的趨勢更為明顯；纈沙坦組中，與高糖組比較，尿量、尿液中肌苷、LDH以及鉀離子濃度值降低的情況

9、得到明顯改善。
　　 2.高糖對大鼠IPK細胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 2.1對大鼠IPK中TGF-β1蛋白表達的影響：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，高糖可刺激大鼠IPK中TGF-p1蛋白的表達，在灌流4h時TGF-β1蛋白的表達水平有所下降，在灌流6h時，TGF-β1蛋白的表達量有所回升；纈沙坦進行干預(yù)后，TGF-β1蛋白的表達水平受到抑制。
　　 2.2對大鼠IPK中VEGF蛋白表達的影響：免疫組織化學(xué)結(jié)果

10、顯示，高糖可刺激大鼠IPK中VEGF蛋白的表達，在灌流開始2h內(nèi)，VEGF在離體灌流腎臟中的表達量明顯高于對照組，灌流2h后，VEGF的表達量有所下降，略高于對照組；纈沙坦進行干預(yù)后，VEGF蛋白的表達水平受到抑制。
　　 2.3對大鼠IPK中PDGF-BB蛋白表達的影響：免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，對照組中，PDGF-BB在離體灌流腎臟中的表達水平逐漸下降；高糖組中，PDGF-BB的表達水平逐漸下降，但高于對照組，在灌流6h時，表達

11、水平有所回升；纈沙坦進行干預(yù)后，PDGF-BB蛋白的表達水平明顯低于高糖組。
　　 第二部分高糖對大鼠系膜細胞細胞因子的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 1.高糖對系膜細胞細胞因子蛋白表達的影響及纈沙坦的干預(yù)作用
　　 1.1對大鼠系膜細胞TGF-βl蛋白表達的影響：免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，正常系膜細胞中，TGF-β1隨著培養(yǎng)時間的延長表達增強；在系膜細胞開始培養(yǎng)2h內(nèi)，高糖可促使TGF-D1蛋白表達增加，培養(yǎng)2h后，

12、TGF-β1的表達水平有所下降，6h時，TGF-β1的表達水平有所有所回升，但與對照組相差不大；纈沙坦進行干預(yù)后，TGF-β1蛋白的表達水平受到抑制。采用ELISA法檢測高糖和纈沙坦條件下，體外培養(yǎng)的系膜細胞細胞液中TGF-β1的含量，結(jié)果顯示：在高糖刺激下，系膜細胞分泌TGF-βI較對照組有所增多，在6h時系膜細胞分泌TGF-β1減少，并低于對照組；加入纈沙坦干預(yù)后，系膜細胞分泌TGF-β1明顯減少，尤其是在培養(yǎng)2h和4h時。

13、　　 1.2對大鼠系膜細胞VEGF蛋白表達的影響：免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，正常系膜細胞中，VEGF隨著培養(yǎng)時間的延長表達增強；在系膜細胞培養(yǎng)0.5h、lh和2h時，高糖可促使VEGF的表達水平逐漸增加，在培養(yǎng)4h和6h時，VEGF的表達水平有所下降，但均高于對照組的表達水平；纈沙坦進行干預(yù)后，VEGF蛋白的表達水平明顯低于高糖組，并具有顯著性差異。
　　 1.3對大鼠系膜細胞PDGF-BB蛋白表達的影響：免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，在

14、對照組中，PDGF-BB在大鼠系膜細胞中有所表達，且隨著培養(yǎng)時間的延長表達增強；高糖刺激PDGF-BB在大鼠系膜細胞中的表達量增加，其表達水平略高于對照組，但無顯著性差異；纈沙坦進行干預(yù)后，PDGF-BB蛋白的表達水平受到抑制。
　　 2.高糖對系膜細胞細胞因子mRNA表達的影響及纈沙坦的干預(yù)作用：RT-PCR結(jié)果顯示，高糖可促進TGF-β1、VEGF和PDGF-BBmRNA的表達，加入纈沙坦后，高糖的刺激作用受到抑制。在培養(yǎng)開

15、始時，TGF-β1 mRNA表達水平較高，VEGF和PDGF-BB mRNA表達水平較低，但隨著培養(yǎng)時間的延長，VEGF和PDGF-BB mRNA表達逐漸加強，而TGF-pI mRNA表達水平有降低的趨勢。
　　 結(jié)論：高糖可以引起離體灌流腎臟功能損傷，使尿量減少、肌酐清除率降低、LDH活性下降，纈沙坦可明顯改善高糖所致離體灌流腎臟功能的損傷。高糖可以刺激離體灌流腎臟和體外系膜細胞培養(yǎng)中TGF-β1、VEGF和PDGF-BB的表