CD28拮抗性類肽、CD137結(jié)合肽的篩選及生物活性測定.pdf

1、第一部分 CD28拮抗性類肽的篩選及其生物活性測定 目的： CD28-B7是T細胞活化最關(guān)鍵的，研究最清楚的協(xié)同刺激通路。阻斷CD28-B7通路是治療自身免疫病及防治移植排斥的重要策略之一。 目前阻斷協(xié)同刺激通路的方法主要是用特異性單克隆抗體封閉，如用抗B7的單抗(抗-CD80/86)阻斷CD28-B7通路，由于現(xiàn)有的單抗主要是鼠源性的，用于人體后可產(chǎn)生免疫反應，引起過敏反應和療效的降低，而人單抗制備困難，

2、基因工程產(chǎn)品技術(shù)要求和造價高，限制了其在臨床的應用。因此，迫切需要研發(fā) 出更為廉價、有效的阻斷劑。 類肽是近年來發(fā)展起來的一種新型小分子受體或酶的阻斷劑，可與受體的配 體結(jié)合位點結(jié)合，阻斷受體與天然配體的結(jié)合，起到受體抑制物的作用。類肽可根據(jù)受體或酶結(jié)合位點的三維空間結(jié)構(gòu)設(shè)計并通過組合化學的方法合成。其優(yōu)點 是有高度的受體親和力和選擇性，在體內(nèi)代謝穩(wěn)定，制備簡單，成本低。 本研究的目的是針對CD28與其配體結(jié)合的

3、特異活性位點，用組合化學的方CD28拮抗性類肽；利用噬菌體展示系統(tǒng)展示具有天然結(jié)構(gòu)的CD28同源 二聚體，以此建立一個簡單、有效、高通量的體外篩選體系；以噬菌體展示CD28為靶標，篩選與CD28高親和力結(jié)合的類肽藥物；在體內(nèi)外進一步檢測CD28拮 抗性類肽藥物的生物活性，為CD28拮抗性類肽藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．CD28拮抗性類肽設(shè)計、合成 根據(jù)CD28的三維空間結(jié)構(gòu)及與B7結(jié)合關(guān)鍵基序，設(shè)計、

4、合成CD28拮抗性類肽藥物，以SYBYL7.0軟件分析類肽藥物與CD28結(jié)合空間結(jié)構(gòu)。此項工作主要由本課題合作單位山東大學藥學院完成。 2．CD28拮抗性類肽篩選平臺的建立—以噬菌體展示具有天然生物活性的CD28靶標 RT-PCR從Jurkat細胞擴增CD28胞外區(qū)，將其克隆入噬菌粒載體pComb3HSS，構(gòu)建的重組載體pComb3HSS—CD28電轉(zhuǎn)入受體菌XLl-Blue，并加輔助噬菌體VCSMl3，使CD28胞外區(qū)

5、同二聚體展示在噬菌體表面。以ELISA、流式細胞儀檢測噬菌體展示CD28的抗原性和與B7-1的結(jié)合力。MTT法檢測噬菌體展示CD28對T細胞增殖的抑制活性。 3.以噬菌體展示的CD28為靶標，對CD28拮抗性類肽進行篩選 (1).CD28拮抗性類肽體外非細胞篩選體系的建立 以噬菌體展示CD28為靶標，建立CD28拮抗性類肽體外非細胞篩選體系，即競爭ELISA實驗：先將類肽藥物與CD28噬菌體一起孵育后，然后

6、將二者的混合物加入包被有抗CD28Ab(或B7)的酶標板上，如果類肽藥物能與CD28噬菌體結(jié)合，則可抑制CD28噬菌體與酶標板上抗CD28Ab(或B7)的結(jié)合，OD值的高低反應類肽藥物與CD28的結(jié)合的能力，二者呈反比關(guān)系。 (2).CD28拮抗性類肽藥物與CD28噬菌體結(jié)合的特異性檢測 包括藥物濃度梯度依賴性實驗，檢測不同濃度類肽藥物與CD28噬菌體結(jié)合的能力；和噬菌體濃度梯度依賴性實驗，檢測相同濃度類肽藥物與不同

7、稀釋度的CD28噬菌體結(jié)合的能力。 4．CD28拮抗性類肽體外生物活性檢測 以類肽藥物對淋巴細胞增殖反應影響，檢測類肽藥物對CD28-B7協(xié)同刺激通路的阻斷效應，包括： (1).<'3>H-TdR法檢測類肽藥物對抗CD28Ab刺激的人T細胞增殖反應影響 (2).<'3>H-TdR法檢測類肽藥物對抗CD28Ab刺激的小鼠T細胞增殖反應影響 (3).<'3>H-TdR法檢測類肽藥物對小鼠混合

8、淋巴細胞反應影響 5．以小鼠GVHD模型檢測類肽藥物體內(nèi)生物活性。 以C57BL/6為供體鼠，BALB/c為受體鼠，建立小鼠GVHD動物模型，并以此模型進一步檢測CD28拮抗性類肽藥物對GVHD的抑制效應。 結(jié)果： 1．CD28拮抗性類肽藥物設(shè)計、合成 根據(jù)CD28空間結(jié)構(gòu)及與B7結(jié)合關(guān)鍵基序，以SYBYL7.0軟件計算機模擬設(shè)計與CD28結(jié)合類肽藥物，并以組合化學方法合成了19種與CD28結(jié)合

9、的類肽藥物。 2．CD28拮抗性類肽篩選平臺的建立一以噬菌體展示具有天然生物活性的CD28靶標 成功構(gòu)建表達人CD28分子胞外區(qū)同二聚體的重組噬菌粒載體pComb3H-CD28，并以噬菌體展示系統(tǒng)展示CD28分子。ELISA和FCM結(jié)果顯示，噬菌體展示CD28可與包被在酶標板上的抗CD28抗體特異性結(jié)合，也可與Jurkat細胞表面CD28競爭結(jié)合抗CD28抗體，具有CD28抗原性。噬菌體展示CD28可與包被在酶標板上的B

10、7-1特異性結(jié)合，也可與Raji細胞表面CD80結(jié)合，具有與配體結(jié)合能力。體外生物活性實驗顯示，噬菌體展示CD28可抑制抗CD28抗體刺激的人外周血淋巴細胞增殖反應。結(jié)果表明噬菌體展示CD28具有抗原性及生物活性，可用于CD28拮抗性類肽藥物的篩選。 3．以噬菌體展示的CD28為篩選體系，對CD28拮抗性類肽進行篩選 以抗CD28Ab包被酶標板的競爭ELISA實驗結(jié)果顯示：CD28噬菌體可以高親和力與酶標板上的抗CD28

11、Ab結(jié)合，分別將10ug的1-19號類肽藥物與CD28噬菌體混合后，則不同程度抑制了CD28噬菌體與酶標板上抗CD28Ab的結(jié)合，其中7和9號藥物與CD28噬菌體的結(jié)合力較好。以9號類肽藥物進行的類肽藥物與CD28噬菌體結(jié)合的特異性檢測顯示，類肽藥物與CD28噬菌體的結(jié)合有藥物濃度依賴性和噬菌體濃度梯度依賴性。 4．CD28拮抗性類肽體外生物活性檢測 (1).人外周血T細胞增殖抑制實驗結(jié)果顯示，加入不同濃度的9號或7號

12、類肽藥物與PHA和抗CD28Ab聯(lián)合應用時，T細胞增殖明顯低于PHA+CD28Ab刺激組，說明類肽藥物可與淋巴細胞表面CD28結(jié)合，從而抑制抗CD28Ab對T細胞的協(xié)同刺激效應。 (2).小鼠和人CD28與配體結(jié)合的關(guān)鍵序列完全相同，因而，與人CD28結(jié)合的類肽也能與小鼠的CD28結(jié)合。同時，藥物的體內(nèi)試驗首先需要在動物體內(nèi)進行，為進一步研究類肽藥物的生物活性，我們首先在體外以<'3>H-TdR法檢測了類肽藥物對抗CD28抗體

13、刺激的C57BL/6小鼠淋巴細胞增殖反應影響。結(jié)果顯示，不同濃度的9號類肽藥物與抗CD3Ab和抗CD28Ab聯(lián)合應用時，C57BL/6小鼠的T細胞增殖明顯低于抗CD3Ab和抗CD28Ab刺激組。 (3).GVHD為供體的淋巴細胞對受體的MHC分子的應答。阻斷CD28-B7途徑是防治GVHD反應的理想靶點。我們在體內(nèi)實驗選擇的動物模型為小鼠GVHD，因而，首先在體外檢測了類肽藥物對供受體鼠混合淋巴細胞反應的影響，為體內(nèi)實驗提供依據(jù)

14、。小鼠混合淋巴細胞反應結(jié)果顯示，一定量的9號類肽藥物可在體外阻斷CD28共刺激信號，從而減輕BALB/C與C57BL/6的混合淋巴細胞反應。 5．以小鼠GVHD模型檢測類肽藥物體內(nèi)生物活性。 以小鼠GVHD為體內(nèi)實驗動物模型，進一步檢測CD28拮抗性類肽對GVHD的抑制效應。供體鼠為C57BL/6，受體鼠為BALB/c。結(jié)果顯示：類肽藥物治療可在早期減輕小鼠異基因骨髓細胞和脾細胞移植后GVHD的臨床癥狀；可在早期延長GV

15、HD小鼠的生存時間，但對長期成存率無明顯影響；類肽藥物可減輕GVHD小鼠肝臟和結(jié)腸病理損傷。 結(jié)論及創(chuàng)新性 1．本研究在國內(nèi)外首次提出以小分子類肽藥物阻斷協(xié)同刺激通路抑制T細胞的活化防治自身免疫病及移植排斥反應，并根據(jù)CD28的空間結(jié)構(gòu)設(shè)計合成了與CD28結(jié)合的類肽藥物。 2．在國內(nèi)外首次提出以噬菌體展示靶標作為類肽藥物的篩選平臺，并以噬菌體展示技術(shù)獲得了具有天然活性的CD28。以噬菌體展示CD28為靶標建立了