甲殼素纖維增強骨組織工程支架材料對血管內(nèi)皮細胞生物活性的影響.pdf

1、目的： 研究新型甲殼素纖維增強骨組織工程支架材料對血管內(nèi)皮細胞生物活性的影響，以初步評價該材料的生物相容性，為臨床篩選更好的骨移植替代材料及血管化組織工程骨的構(gòu)建提供實驗依據(jù)。 方法： 一、血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與鑒定無菌條件下取健康產(chǎn)婦分娩的新鮮臍帶，24h內(nèi)采用血管內(nèi)灌注消化液法原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，Ⅷ因子免疫組化染色鑒定血管內(nèi)皮細胞。 二、觀察復(fù)合支架材料上內(nèi)皮細胞的粘附生長情況體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮

2、細胞并與復(fù)合支架材料聯(lián)合培養(yǎng)。六塊支架材料分別置于24孔培養(yǎng)板的六個孔中，傳至第3代的人臍靜脈內(nèi)皮細胞按5×10<'5>cells/cm<'2>分別接種于支架上，37±0.5℃、5﹪CO<,2>，飽和濕度培養(yǎng)箱中放置4h后加培養(yǎng)基浸沒材料，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。相差顯微鏡下逐日觀察細胞與支架材料的附著情況，并分別于第3d、5d各取出三塊復(fù)合細胞的支架材料，掃描電子顯微鏡觀察細胞在支架材料上的生長情況。 三、MTT比色試驗測定復(fù)合支

3、架材料對內(nèi)皮細胞增殖的影響支架材料環(huán)氧乙烷消毒，浸提介質(zhì)為DMEM培養(yǎng)基(含20﹪FBS，PH7.2～7.4)，按照IS010993-1標準要求，試樣表面積/浸提介質(zhì)=3cm<'2>/ml，將材料浸入培養(yǎng)基中，置于37±0.5℃，5％CO<,2>，飽和濕度培養(yǎng)箱中7d，吸出浸提液，無菌封存于4℃冰箱中備用。試驗分三組，分別為浸提液組、陰性對照組和陽性對照組。將內(nèi)皮細胞以1～5×10<'4>cells/ml、分三組接種于96孔培養(yǎng)板中，每

4、組設(shè)復(fù)孔6個，每孔體積200μl，置于37±0.5℃，5％CO<,2>，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后棄去原培養(yǎng)液，三組分別加入浸提液、DMEM培養(yǎng)基(含20％FBS、PH7.2～7.4)、0.7％(質(zhì)量分數(shù))聚丙烯酰胺(PVC)，分別于1、2、3、4、5d進行MTT比色試驗，選擇540nm波長，測定各孔光吸收值，以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理，各時間點浸提液組及陽性對照組分別與陰性對照組