肌細胞增強因子2A對血管內(nèi)皮細胞功能的影響及其機制探討.pdf

1、背景
　　 冠心病是危害人類健康的心血管疾病之一，其發(fā)病機制尚不完全清楚。目前已經(jīng)明確高血壓、高膽固醇血癥、肥胖、吸煙、糖尿病是冠心病的危險因素。冠心病是一類受環(huán)境影響較大的多基因遺傳病，具有遺傳傾向性。但其遺傳相關(guān)病因一直末能完全揭示。因此尋找冠心病和動脈粥樣硬化易感基因一直是心血管病研究的重點。隨著分子遺傳學的發(fā)展，基因突變及基因多態(tài)性與早發(fā)冠心病的關(guān)系近年來倍受關(guān)注。
　　 肌細胞增強因子-2屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MAD

2、S-box家族，在脊柱動物中家族成員包括四種轉(zhuǎn)錄因子MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D，最初被稱為肌細胞特異性DNA結(jié)合蛋白，突出的功能是控制肌細胞分化過程中的基因轉(zhuǎn)錄。然而，最近的一些研究報告表明，MEF2蛋白還在多種細胞的信號傳導(dǎo)，激活遺傳程序、控制細胞分化、增殖、細胞形態(tài)學、生存和凋亡等方面發(fā)揮著重要的作用。MEF2轉(zhuǎn)錄因子以同源或異源二聚體形式發(fā)揮作用，其蛋白多結(jié)合在許多肌特異性基因的調(diào)控區(qū)域控制轉(zhuǎn)錄過程。
　

3、　 2003年Wang等人首次報道轉(zhuǎn)錄因子MEF2A的突變基因作為家族性CHD致病基因，從基因水平探討了CHD的發(fā)病機制，提出了CHD發(fā)病機制中的一個新的信號通路。MEF2A基因位于染色體15q26.3，在冠狀動脈內(nèi)皮細胞中高度表達。Wang等人的研究顯示，MEF2A影響CHD發(fā)病的機理可能是基因突變使基因表達的轉(zhuǎn)錄過程發(fā)生改變，從而使血管內(nèi)皮發(fā)育異常，形成不正?；蚬δ苋睋p的血管內(nèi)皮，繼而促進單核細胞的侵入和內(nèi)皮下基質(zhì)的暴露造成動脈粥

4、樣硬化斑塊和血栓的形成，導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生。該研究成果被美國心臟病協(xié)會評為2004年的十大進展之一。然而，也有多個研究小組發(fā)現(xiàn)在眾多散發(fā)與家族性CHD患者中未發(fā)現(xiàn)MEF2A基因突變與CHD的關(guān)系，因而對MEF2A突變的致病性存在爭議。
　　 內(nèi)皮細胞位于血管腔表面，是一個巨大的屏障體系，可分泌一系列血管活性物質(zhì)和細胞因子作用于血管壁和管腔維持正常血管緊張度、防止血小板黏附和血栓形成、維持血液流動性、抑制血管炎癥和平滑肌細

5、胞增殖、防止炎癥細胞的浸潤和有害物質(zhì)的透入等維持血管內(nèi)平衡。一氧化氮(NO)又稱內(nèi)皮舒張因子(EDRF)是維持這些功能的重要細胞因子。血脂異常(如氧化修飾LDL升高)、吸煙、高血壓、肥胖、糖尿病等諸多因素均可刺激血管內(nèi)皮分泌大量的細胞因子和炎性介質(zhì)，引發(fā)炎癥反應(yīng)，促進炎性細胞與內(nèi)皮細胞的粘附和血栓形成，從而誘導(dǎo)動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)生。
　　 NF-κB參與許多基因，特別是與機體防御反應(yīng)有關(guān)的早期應(yīng)答基因的表達調(diào)控。在機體多種

6、生物學活性物質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用，并參與了動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)。哺乳類動物核因子κB(NF-κ3)轉(zhuǎn)錄因子家族包括五個成員：Rel、RelA、RelB、NF—κB1(即p50)、NF-κB2。常見的激活形式是由多肽鏈p65和p50蛋白亞基構(gòu)成的異源二聚體，其激活形式包括p50同源_二聚體，p65同源二聚體和p50～p65異源二聚體。激活NF—κB引起白細胞黏附分子如VCAM-1等的表達增加。VCAM-1與受體α4β1

7、整合素結(jié)合可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞內(nèi)信號改變使內(nèi)皮細胞變形，介導(dǎo)單核細胞、淋巴細胞與內(nèi)皮細胞或血管平滑肌細胞的黏附。
　　 目前的研究也顯示，氧化修飾型LDL可以不同程度的激活NF-κB，激活的NF-κB參與了粘附分子如血管細胞粘附因子-1(VCAM-1)的調(diào)節(jié)以及某些細胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。而突變的MEF2A具體影響內(nèi)皮細胞哪些功能以及其具體作用機制尚不為人知。我們的研究顯示MEF2A基因有可能通過影響血管內(nèi)皮細胞NF-κB參與內(nèi)皮功能的調(diào)

8、節(jié)，但具體的作用以及信號通路仍需進一步的研究。
　　 目的：
　　 本研究利用冠心病相關(guān)基因MEF2A野生型及其21個堿基突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞株，通過檢測內(nèi)皮細胞的增殖、一氧化氮、粘附功能、核內(nèi)NF—κBp65的水平等方面，探討MEF2A影響內(nèi)皮細胞功能改變的可能機制；并加以ox-LDL不同時間刺激正常血管內(nèi)皮細胞后，觀察內(nèi)皮MEF2A蛋白的表達情況以及內(nèi)皮粘附功能的改變，從而闡明基因與環(huán)境因素共同作用對疾病的

9、影響。本實驗旨在通過MEF2A對內(nèi)皮功能的影響以及機制的研究，探討MEF2A基因與動脈粥樣硬化的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.實驗質(zhì)粒由美國Dr.Wang饋贈，經(jīng)測序證實。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a進行體外質(zhì)粒擴增。HUVEC分為對照組(pc-DNA3-GFP質(zhì)粒，control組)、野生型組(pc—DNA3-MEF2A質(zhì)粒，WT組)與突變組(pc-DNA3-21堿基缺失型質(zhì)粒，Δ21組)，使用脂質(zhì)體Lipofect

10、ime2000轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞與Hela細胞，MEF2A質(zhì)粒均帶有Flag標簽，F(xiàn)lag蛋白檢測確定轉(zhuǎn)染是否成功。
　　 2.通過流式細胞儀檢測GFP蛋白的表達，選擇最佳的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法。Western-blot檢測MEF2A蛋白的表達水平。
　　 3.熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 4.細胞免疫熒光檢測各組MEF2A蛋白細胞內(nèi)定位。
　　 5.HUVEC分為對照組、WT組、△21組和siR

11、NA組四組，轉(zhuǎn)染后檢測各組內(nèi)皮細胞的增殖、NO水平。
　　 6.收集上述細胞，提取總蛋白與核蛋白，檢測各組的粘附功能、核內(nèi)NF-κB的水平。
　　 7.熒光染料BCECF—AM處理的Thp-1細胞與內(nèi)皮細胞共孵育，進行單核細胞-內(nèi)皮細胞粘附試驗。
　　 8.不同時間點，ox-LDL(50μg/ml)刺激正常內(nèi)皮細胞：ox-LDL刺激內(nèi)皮細胞0、6、12、24、36小時，收集細胞提取總蛋白與核蛋白檢測MEF2A蛋白

12、、粘附因子VCAM-1、以及核內(nèi)NF-κBp65的水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.脂質(zhì)體Lipofectime2000將目的基因轉(zhuǎn)染入人臍靜脈內(nèi)皮細胞，轉(zhuǎn)染后檢測到Flag蛋白表達，說明轉(zhuǎn)染成功，且使用流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染效率為70％。
　　 2.MEF2A野生型和突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞以及對照組內(nèi)皮細胞均可檢測到MEF2A蛋白的表達；與對照組相比較，WT組與突變組MEF2A蛋白均過表達，而后兩組之間比較沒有明顯

13、差別。
　　 3.熒光素酶檢測顯示，突變組質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性低于野生組。
　　 4.細胞免疫熒光結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒的內(nèi)皮細胞MEF2A蛋白主要定位于細胞核，而△21組內(nèi)皮細胞MEF2A蛋白部分滯留在胞漿。
　　 5.蛋白印跡法顯示，siRNA組MEF2A蛋白表達較WT組減少了80％；與對照組相比，野生型組和△21突變組MEF2A蛋白表達均顯著增加，后兩者之間比較則無明顯差異。
　　 6.MEF2A對增殖的

14、影響：轉(zhuǎn)染48小時，野生型組增殖率(0.648±0.053)明顯高于對照組(0.344±0.022，p<0.01)；與野生型比較，突變組和siRNA組內(nèi)皮細胞增殖率下降36.2％(p<0.01)和63.6％p<0.01)。
　　 7.NO表達的結(jié)果：轉(zhuǎn)染后24、36、48小時，WT組與對照相比較，內(nèi)皮細胞一氧化氮水平表達增加，差異有顯著性(p<0.01)；轉(zhuǎn)染36小時與48小時，siRNA組和△21組NO表達下降，與野生型組相比

15、差異均有顯著性(p<0.01)，其中siRNA組下降更為明顯。
　　 8.VCAM-1的表達情況：WT組(0.076±0.011)與對照組(0.192±0.023)比較，VCAM-1的表達明顯下降(p<0.01)。siRNA組(0.435±0.037)和△21組(0.207±0.018)的VCAM-1的表達水平均明顯升高，與野生型組(0.076±0.011)相比較有顯著差異，其中siRNA組差異更為顯著(p<0.01)。

16、　　 9.單核內(nèi)皮粘附的結(jié)果：WT組與對照相比較，粘附于內(nèi)皮細胞的Thp-1細胞數(shù)目減少(p<0.05)，siRNA組粘附于內(nèi)皮細胞的Thp-1細胞數(shù)目較野生型組明顯增加，差異有顯著性(p<0.01)；△21組與野生型組相比，粘附的Thp-1細胞增加，差異有顯著性(p<0.05)。
　　 10.NF-κBpp65的表達情況：蛋白印跡法顯示，WT組NF-κB p65表達量較對照組明顯減少(p<0.05)，siRNA組和△21突變

17、組NF-κB p65蛋白表達均較WT組顯著增加，其中siRNA組增加更為明顯(p<0.01)。
　　 11.隨著50μg/ml ox-LDL作用HUVEC時間的延長，人靜脈內(nèi)皮細胞MEF2A的表達逐漸減少，呈時間依賴性。NF—κB p65以及VCAM-1蛋白的表達逐漸增加，在24小時時蛋白水平達最大值。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功的使用脂質(zhì)體進行MEF2A基因的轉(zhuǎn)染，內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染效率較好。
　　 2.此

18、基因的21個堿基缺失型突變沒有改變細胞MEF2A蛋白的表達，但是該質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄活性較野生型明顯下降；野生型基因轉(zhuǎn)染后的細胞表達的MEF2A蛋白定位于胞核，突變后表達的蛋白則滯留在胞漿。雖然該突變位點沒有位于核定位信號區(qū)(nuclear localization signal，NLS)，但是同樣引起蛋白的定位發(fā)生了變化。
　　 3.MEF2A基因參與了血管內(nèi)皮細胞增殖的調(diào)節(jié)。
　　 4.MEF2A基因影響內(nèi)皮細胞NO分子的表達