含HIV-1 gagpol基因的重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒的構(gòu)建及表達(dá)的初步研究.pdf

1、背景：HIV病毒引起的艾滋病(AIDS)是一種全球性疾病，蔓延速度快，死亡率高。目前臨床上抗HIV治療藥物昂貴、不良反應(yīng)多，且只能起到延緩艾滋病發(fā)生的作用。因而研制有效的艾滋病疫苗則是控制AIDS流行甚至根除AIDS的理想而可行的途徑。近年來活載體疫苗由于其能產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，受到了許多研究人員的重視。利用缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒作為載體，將艾滋病病毒核心蛋白基因gag,多聚酶基因 pol 進(jìn)行重組并與脊髓灰質(zhì)炎病毒載體鏈接，得到含艾滋病

2、病毒基因的重組脊髓灰質(zhì)炎病毒，能夠誘導(dǎo)系統(tǒng)性的體液免疫與細(xì)胞免疫反應(yīng)，有很大的應(yīng)用前景。目前國內(nèi)還未見用脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體構(gòu)建HIV重組疫苗的正式報道。 目的：為了能夠有效的預(yù)防和治療艾滋病，為將來真正應(yīng)用于臨床的HIV疫苗提供實驗基礎(chǔ)，本研究以缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒為載體，插入HIV-1 gagpol基因，構(gòu)建含gagpol基因的重組缺陷性脊髓灰質(zhì)炎疫苗，并研究其表達(dá)、形態(tài)及是否可引起免疫反應(yīng)。 方法：1、含HIV-

3、1 gagpol基因的重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體的構(gòu)建：選擇HIV-1B亞型代表毒株，以質(zhì)粒pT7agpol為模板，將其插入缺少VP1及VP4段基因的脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體pSVA14中，構(gòu)建重組脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體，并對其進(jìn)行PCR、內(nèi)切酶鑒定。2、HIV-1 gagpol基因表達(dá)的檢測：(1)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，G418進(jìn)行壓力篩選得到轉(zhuǎn)入重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體的細(xì)胞株A549-gagpol，R

4、T-PCR和免疫酶法檢測混合細(xì)胞系中HIV-1 gagpol基因的表達(dá)，鑒定是否有目的基因的插入。(2)將重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒感染293細(xì)胞，采用Western blot方法檢測重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒能否感染細(xì)胞并表達(dá)目的基因。3、重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒形態(tài)學(xué)鑒定：通過重組痘苗病毒提供缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒的衣殼蛋白，組裝重組脊髓灰質(zhì)炎病毒完整顆粒，并通過氯仿－PEG/NaCL－氯仿三步法純化重組脊髓灰質(zhì)炎病毒，電鏡下觀察重組病毒形態(tài)。

5、4、重組缺陷脊髓灰質(zhì)炎病毒的遺傳穩(wěn)定性分析： 將重組脊髓灰質(zhì)炎病毒感染的293細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)傳代檢測疫苗的安全性及遺傳穩(wěn)定性。結(jié)果： 1、構(gòu)建重組HIV-1 gagpol基因脊髓灰質(zhì)炎病毒通過PCR，酶切鑒定證實HIV-1 gagpol基因片斷正確的插入到脊髓灰質(zhì)炎病毒載體。2、RT-PCR的方法檢測到HIV-1 gagpol基因在含重組脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體的細(xì)胞系A(chǔ)549-gagpol中可以有效的轉(zhuǎn)錄；通過免疫酶法可以檢測到細(xì)

6、胞系中HIV-1gagpol的表達(dá)；Western blot方法檢測到重組脊髓灰質(zhì)炎病毒能感染細(xì)胞并表達(dá)目的基因。3、電鏡觀察重組病毒顆粒呈直徑20-30nm的對稱二十面體，具有典型的脊髓灰質(zhì)炎病毒顆粒形態(tài)。4、重組脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗具有安全性及遺傳穩(wěn)定性。 結(jié)論：1、首次構(gòu)建了表達(dá)HIV-1 gagpol基因片段的重組脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體，使用缺陷性脊髓灰質(zhì)炎病毒表達(dá)載體表達(dá)結(jié)構(gòu)基因和早期基因的一個明顯優(yōu)勢是可以引起較強及長