膿毒癥新生大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化異常導(dǎo)致后期認(rèn)知功能障礙的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、圍生期的感染暴露會(huì)引起新生兒后期的神經(jīng)疾病或神經(jīng)精神疾病，但其機(jī)制不明，越來(lái)越多的證據(jù)表明后期的神經(jīng)功能障礙可能與早期感染刺激導(dǎo)致的異常的海馬神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)。本研究旨在探索小膠質(zhì)細(xì)胞起源的白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）對(duì)膿毒癥新生幼鼠海馬和側(cè)腦室神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化成熟的影響。出生后1天的Sprague-Dawley大鼠分為L(zhǎng)PS組和對(duì)照組。LPS組幼鼠進(jìn)行腹腔注射脂多糖（lipopolysaccaride，LP

2、S）（1 mg/kg），對(duì)照組幼鼠進(jìn)行腹腔注射等體積的0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution, PBS）。在注射LPS/PBS后的第28天（28d）用Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)兩組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。用免疫熒光（immunofluorescence, IF）和蛋白印跡（Western blot, WB)檢測(cè)兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬炎癥因子IL-1β的定位表達(dá)，同時(shí)觀察不同時(shí)間點(diǎn)海馬齒狀回（d

3、entate gyrus, DG）神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化，成熟神經(jīng)元數(shù)量及突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)。在Morris水迷宮試驗(yàn)中，LPS組的逃逸潛伏期在隱蔽站臺(tái)試驗(yàn)中的第3天（P=0.035），第4天（P=0.017）和第5天（P=0.012）比對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，在空間探索試驗(yàn)中穿越原平臺(tái)次數(shù)（2.30±1.95比3.90±1.77，P=0.002）比對(duì)照組明顯減少。LPS組海馬CA1區(qū)表達(dá)IL-1β的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量在腹腔注射LPS后的24小時(shí)（2

4、4h）和3天（3d）明顯比對(duì)照組增多，同時(shí)WB檢測(cè)到LPS組海馬IL-1β表達(dá)水平在24h（0.60±0.05比0.53±0.02，P=0.026）明顯上調(diào)，在3d（0.80±0.22比0.38±0.07，P=0.027）時(shí)達(dá)到高峰，在7d（0.59±0.09比0.49±0.18，P=0.358）后與對(duì)照組無(wú)明顯差異，同時(shí)可以觀察到皮層和海馬的CA1區(qū)成熟神經(jīng)元的凋亡比對(duì)照組明顯增多。在海馬的齒狀回觀察到LPS組Sox2/Ki-67標(biāo)記

5、的增殖的神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量在24h（22.92±9.31比38.17±12.29， P=0.000）和3d（21.25±11.73比43.46±7.93，P=0.000）時(shí)比對(duì)照組明顯下降，在7d（52.34±12.58比18.56±9.32，P=0.000）和14d（14.00±2.66比3.71±1.25，P=0.001）比對(duì)照組明顯上升，在28d（3.55±0.62比3.10±0.58，P=0.279）時(shí)與對(duì)照組無(wú)明顯差別。同樣地在

6、側(cè)腦室也觀察到LPS組Sox2/Ki-67標(biāo)記的增殖的神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量在24h和3d時(shí)比對(duì)照組明顯降低，在7d時(shí)比對(duì)照組明顯增多。此外，用WB可檢測(cè)到LPS組海馬Sox2蛋白的表達(dá)水平在7d（1.11±0.14比0.90±0.11，P=0.037），14d（1.01±0.10比0.82±0.10，P=0.015）均比對(duì)照組明顯增高，在28d時(shí)（0.42±0.08比0.35±0.05，P=0.243）與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。為檢測(cè)神經(jīng)干

7、細(xì)胞的分化情況，用IF檢測(cè)Dcx標(biāo)識(shí)的不成熟神經(jīng)元的數(shù)量，可以觀察到LPS組海馬齒狀回顆粒下層Dcx標(biāo)識(shí)的細(xì)胞數(shù)量在7d和14d明顯比對(duì)照組增多，而在28d時(shí)比對(duì)照組明顯減少。進(jìn)一步用WB檢測(cè)海馬Dcx蛋白的表達(dá)水平得到了同樣的結(jié)果。為檢測(cè)神經(jīng)元的成熟情況，WB檢測(cè)到LPS組NeuN的表達(dá)在7d（0.14±0.03比0.19±0.0.06，P=0.018）和14d明顯下降（0.48±0.11比0.54±0.05，P=0.027），在28

8、d（0.90±0.22比0.92±0.11，P=0.804）時(shí)與對(duì)照組的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IF也檢測(cè)到同樣的結(jié)果。為檢測(cè)神經(jīng)元的突觸形成情況，用IF和WB檢測(cè)突觸前膜蛋白（突觸素，synaptophysin）和突觸后膜蛋白（突觸后致密蛋白95，postsynaptic density protein95，PSD-95）的表達(dá)情況，WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS組的synaptophysin表達(dá)在7d（0.24±0.03比0.48±0.05，P=0.

9、004），14d（0.67±0.16比0.72±0.19，P=0.02）時(shí)均比對(duì)照組下調(diào)，在28d（0.81±0.13比0.82±0.12，P=0.895）時(shí)恢復(fù)對(duì)照組水平，而兩組PSD-95表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都相對(duì)恒定且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明早期LPS暴露會(huì)激活海馬小膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β，其可能會(huì)引起廣泛神經(jīng)元丟失及海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化成熟障礙，從而導(dǎo)致海馬內(nèi)神經(jīng)突觸形成失調(diào)，這可能是膿毒癥新生幼鼠后期學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能缺陷的機(jī)制之