川芎嗪改善膿毒癥大鼠肝細胞線粒體功能障礙及其分子機制的研究.pdf

1、目的：
　　膿毒癥是一種由嚴重感染引起的過度炎癥反應的臨床綜合征?？梢鸲嗥鞴俟δ苷系K綜合征(MODS)，最終可引起器官衰竭，臨床預后差，死亡率高。在膿毒癥過程中，肝臟對清除細菌的防御反應和產(chǎn)生炎癥介質(zhì)起著重要的作用。此外，膿毒癥引起的多器官損傷和衰竭可能是由于線粒體功能惡化和細胞能量代謝衰竭引起的。線粒體通過提供能量，利用大約98％的全身氧來維持正常的細胞功能。因此，線粒體在維持正常的器官功能中起著重要的作用。另一方面，保持線粒

2、體結(jié)構(gòu)的完整性是正常的線粒體功能及能量代謝必不可少的。膿毒癥狀態(tài)下，主要表現(xiàn)為細胞病理性缺氧，氧利用障礙，導致能量產(chǎn)生下降，而線粒體功能降低是細胞氧利用障礙的根本原因。膿毒癥時會出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)損傷與功能障礙，線粒體損傷的同時會誘發(fā)促炎介質(zhì)的釋放，加重炎癥反應，同時線粒體功能障礙導致組織細胞產(chǎn)生能量不足，引起嚴重的微循環(huán)障礙，直至多器官功能衰竭?？梢娋€粒體功能障礙往往與失調(diào)的全身炎癥反應引起的多器官功能衰竭相關(guān);然而，線粒體功能障礙的確切

3、機制尚不完全清楚。
　　川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中藥川芎的一種活性提取物，廣泛應用于抗炎和治療心血管疾病。TMP可抑制脂質(zhì)過氧化，作為滅活活性氧、保護酶的抗氧化劑。TMP還具有抗炎和器官保護作用，并在細胞水平上改善線粒體功能。然而，這些影響作用的分子機制仍然不清。水通道蛋白8(Aquaporin-8，AQP8)位于肝細胞內(nèi)線粒體膜，主要介導水和其他代謝底物的運輸，對維持線粒體的正常結(jié)構(gòu)十分必要。A

4、QP8還通過誘導細胞快速腫脹，促進IL-1β釋放而介導炎癥。另一方面，線粒體敲除AQP8基因能導致氧化劑誘導的線粒體功能障礙和導致人肝腫瘤細胞壞死性死亡。在腫瘤壞死因子α（TNF-α）介導的膿毒癥實驗動物模型中，肝細胞AQP8的表達可能通過其轉(zhuǎn)錄后抑制的機制而被下調(diào)，導致AQP8介導的水向線粒體外的轉(zhuǎn)運功能下降，線粒體體積的快速膨脹，線粒體破裂。這些證據(jù)表明AQP8可能在維持正常的線粒體功能中起重要的作用。以往的研究表明，川芎嗪可能通過

5、增加AQP8表達保護膿毒癥大鼠肝細胞線粒體的結(jié)構(gòu)。然而，TMP能否通過改善線粒體功能保護肝臟免受炎癥損害，在膿毒癥大鼠模型中AQP8和炎癥反應之間是否存在相互影響仍不清楚。在當前的研究中，試圖進一步探討TMP對線粒體功能的影響，闡明TMP在治療膿毒癥致急性肝損傷中對線粒體保護作用的潛在機制。
　　方法：
　　選用96只SD大鼠，隨機分為正常對照組、膿毒癥組、TMP治療組和TMP預防組，每組24只。使用盲腸結(jié)扎穿孔(cecal

6、 ligation and puncture，CLP)法制備膿毒癥實驗動物模型，對照組實驗動物僅接受假手術(shù)處理;膿毒癥組進行CLP手術(shù);治療組在CLP手術(shù)完成后，立即從大鼠尾靜脈注射鹽酸川芎嗪注射液，劑量為60mg/kg;預防組在CLP手術(shù)處理前7天開始每天從大鼠尾靜脈注射60mg/kg鹽酸川芎嗪注射液。
　　造模18小時后，在四組大鼠中隨機抽取12只處死，留取肝臟和血清標本，部分肝臟組織固定、包埋后保存，余肝臟組織及血清保存在零

7、下80℃冰箱中。每組剩余12只大鼠觀察至出現(xiàn)明顯膿毒癥癥狀及至死亡的時間，并繪制生存曲線。
　　生化分析儀直接檢測大鼠血清ALT、AST、m-AST的水平。雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平。提取部分肝臟組織標本，采用ATP檢測試劑盒，測定組織中ATP含量。
　　取包埋后的大鼠肝臟制備50nm厚度的電鏡切片，使用4％的醋酸鈾酰和0.5％的醋酸鉛染色后，電鏡下觀察肝細胞線粒體

8、的超微結(jié)構(gòu);按照Flameng分級方法對肝臟線粒體進行半定量分析。
　　差速離心法提取肝細胞線粒體，JC-1對線粒體進行染色，激光共聚焦顯微鏡及流式細胞儀檢測熒光強度，通過綠色熒光/紅色熒光的比值，間接反映線粒體膜電位變化。
　　取肝細胞線粒體，采用分光光度法，測定線粒體膜Na+-K-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性。
　　裂解肝細胞線粒體，分離出線粒體內(nèi)膜蛋白，采用We

9、stern blot法檢測AQP8蛋白，采用實時定量熒光聚合酶鏈式反應(Real-time PCR)法檢測肝組織AQP8mRNA的表達。
　　使用SPSS14.0統(tǒng)計學軟件包進行統(tǒng)計學分析。各組大鼠實驗結(jié)束至出現(xiàn)膿毒癥癥狀的時間、大鼠存活時間，大鼠血清ALT、AST、m-AST的水平，血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平，大鼠肝細胞ATP含量，肝細胞線粒體膜ATP酶活性，AQP8mRNA表達、AQP8蛋白表達

10、使用均數(shù)±標準差((x)±s)表示，組間比較采用方差分析(ANOVA)進行處理;AQP8蛋白表達與血清ALT、AST、m-AST，肝細胞ATP含量，血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平的相關(guān)性分析使直線相關(guān)性檢驗。
　　結(jié)果：
　　1.大鼠手術(shù)結(jié)束至出現(xiàn)膿毒癥癥狀的時間和存活時間
　　膿毒癥組大鼠手術(shù)結(jié)束至出現(xiàn)癥狀的時間較治療組和預防組短(P＜0.01);治療組和預防組的大鼠存活時間較膿毒癥組長（

11、P＜0.01）;治療組和預防組兩組大鼠出現(xiàn)膿毒癥癥狀的時間和存活時間均無顯著差異(P＞0.05)。
　　2.肝臟組織中ATP含量及血清ALT、AST、m-AST的水平
　　與正常對照組相比，膿毒癥組大鼠肝臟組織中ATP含量明顯減低(P＜0.01);與膿毒癥組比較，治療組和預防組肝臟組織中ATP含量升高(P＜0.01)。
　　與正常對照組比較，膿毒癥組血清ALT、AST、m-AST的水平明顯升高(P＜0.01);與膿毒癥

12、組相比，治療組和預防組血清ALT、AST、m-AST的水平降低(P＜0.01)。
　　3.肝細胞線粒體結(jié)構(gòu)的變化
　　電鏡觀察大鼠肝細胞線粒體發(fā)現(xiàn)膿毒癥組線粒體體積增大，嵴明顯腫脹、并有空泡樣變，外膜破裂，線粒體內(nèi)出現(xiàn)脂肪變性。而在治療組和預防組，大鼠肝細胞線粒體上述變化，如腫脹、空泡樣改變等均較膿毒癥組減輕。膿毒癥組肝臟線粒體電鏡半定量評分較對照組明顯增加(P＜0.01);TMP治療組和預防組肝臟線粒體電鏡半定量評分較膿毒

13、癥組明顯降低(P＜0.01)。
　　4.肝臟細胞線粒體膜電位
　　激光共聚焦及流式細胞儀檢測肝臟線粒體膜電位結(jié)果表明:膿毒癥組大鼠肝臟線粒體膜電位明顯低于對照組（P＜0.01），而治療組和預防組大鼠肝細胞線粒體膜電位高于膿毒癥組(P＜0.01)。
　　5.肝臟細胞線粒體ATP酶活性
　　與對照組比較，膿毒癥組肝細胞線粒體Na+-K+-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性

14、水平明顯下降(P＜0.01)，與膿毒癥組相比，治療組和預防組肝細胞線粒體Na+-K+-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明顯升高(P＜0.01)。而治療組和預防組之間則沒有顯著性差異(P＞0.05)。
　　6.肝細胞線粒體AQP8mRNA的表達
　　與對照組比較，膿毒癥組大鼠肝細胞線粒體AQP8mRNA的表達降低（P＜0.01）;膿毒癥組線粒體AQP8mRNA的表達低于治療組和預

15、防組的(P＜0.01);而治療組和預防組之間則沒有顯著性差異(P＞0.05)。
　　7.肝細胞線粒體AQP8蛋白的表達
　　與對照組比較，肝細胞線粒體AQP8蛋白的相對表達量在膿毒癥組明顯減少(P＜0.01);治療組和預防組的AQP8蛋白相對表達量較膿毒癥組升高(P＜0.01)，在治療組和預防組之間則沒有顯著性差異（P＞0.05）。
　　8.血清炎癥因子水平
　　與對照組比較，膿毒癥組大鼠血清IL-1β、IL-6

16、、HGMB1、TNF-α和NO水平顯著增加(P＜0.01)，而TMP治療組及預防組大鼠血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平低于膿毒癥組(P＜0.01)。
　　9.相關(guān)性分析
　　大鼠肝細胞線粒體AQP8蛋白的表達與血清ALT、AST、m-AST的水平呈負相關(guān)(P＜0.01)，大鼠肝細胞線粒體AQP8蛋白的表達量與肝細胞ATP含量、線粒體膜電位水平呈正相關(guān)（P＜0.01）。大鼠肝細胞線粒體AQP8蛋白的表

17、達與血清NO、TNF-α水平負相關(guān)(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.川芎嗪可以延緩大鼠CLP手術(shù)后出現(xiàn)膿毒癥癥狀的時間，延長膿毒癥大鼠的生存時間。
　　2.膿毒癥大鼠血清炎癥因子釋放增加，肝細胞線粒體AQP8、AQP8mRNA表達下降、并出現(xiàn)肝細胞ATP含量下降、線粒體ATP酶活性下降、線粒體膜電位下降等線粒體功能障礙，同時線粒體結(jié)構(gòu)變化，還出現(xiàn)肝功能損害。而線粒體AQP8蛋白的表達與肝臟酶學指標的呈負相關(guān)，與肝

18、細胞ATP含量及線粒體膜電位呈正相關(guān)，與血清TNF-α、NO水平呈負相關(guān)。
　　3.川芎嗪能改善膿毒癥大鼠的肝功能，保護肝細胞線粒體功能，其機制可能包括:
　　(1)川芎嗪可以通過上調(diào)線粒體AQP8蛋白的表達、保護線粒體ATP酶活性，穩(wěn)定線粒體膜電位來發(fā)揮對膿毒癥大鼠肝線粒體損傷的保護作用。
　　(2)川芎嗪可以抑制TNF-a、IL-1β、IL-6、HGMB1、NO等多種炎癥介質(zhì)的過量釋放，從而抑制膿毒癥發(fā)生時失控的炎