心脈隆注射液對新生SD大鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖分化的影響.pdf

1、傳統(tǒng)觀點認為，成人神經(jīng)細胞損傷后無法再生，功能無法重建，以致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及變性疾病患者的神經(jīng)功能很難恢復(fù)。近年研究發(fā)現(xiàn)，在胚胎期和成年期哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中存在具有自我增殖、自我更新和多向分化潛能的神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSCs)，神經(jīng)干細胞由胚胎早期的神經(jīng)上皮細胞產(chǎn)生，能夠分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)不能再生的傳統(tǒng)理論提出了挑戰(zhàn)，為研究神經(jīng)細胞的再生和功能重建帶來了新

2、前景。然而，自然情況下，神經(jīng)干細胞大部分分化為膠質(zhì)細胞，僅少量分化為神經(jīng)元，目前尚無法有效控制神經(jīng)干細胞定向分化為特定的神經(jīng)細胞，因此，如何調(diào)控NSCs定向分化為功能性神經(jīng)元成為神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點和難點之一。心脈隆注射液(xinmailonginjection，XML)是從昆蟲美洲大蠊體內(nèi)提取的核苷類化合物，有實驗研究結(jié)果表明，美洲大蠊提取物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、促血管增生和組織修復(fù)、清除自由基等作用。本實驗旨在觀心脈隆注

3、射液對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞增殖分化作用的影響，探討其是否可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化。
　　 目的:
　　 建立新生SD大鼠海馬神經(jīng)干細胞體外分離培養(yǎng)方法;并鑒定神經(jīng)干細胞;探討心脈隆注射液對新生SD大鼠海馬神經(jīng)干細胞增殖分化作用的影響。
　　 方法:
　　 1、從新生24h內(nèi)SD大鼠腦組織中分離海馬，采用無血清懸浮培養(yǎng)，并進行傳代培養(yǎng)，相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，將第3代以免疫細胞化學(xué)法檢測Nestin、5

4、-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyUridine，Brdu）表達和神經(jīng)干細胞分化后微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associatedprotein2，MAP-2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）的表達。
　　 2、將終濃度為0.5％、1％、2％的心脈隆注射液加入到第3代神經(jīng)干細胞單細胞懸液中有血清貼壁培養(yǎng)并分實驗組和對照組。每3d更換分化培養(yǎng)基1次

5、，干預(yù)5d后倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)干細胞的形態(tài)。
　　 3、采用免疫熒光化學(xué)染色，觀察分化后細胞MAP-2、GFAP表達情況，應(yīng)用ImageProplus6.0軟件計數(shù)MAP-2陽性細胞數(shù)，并計算分化率。
　　 4、四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT法）觀察心脈隆注射液對神經(jīng)干細胞增殖能力的影響。
　　 5、將終濃度為2％的心脈隆注射液加入到第3代神經(jīng)干細胞單細胞懸液中有血清培養(yǎng)，并設(shè)立對照組，5～7d后用RTQ-PCR

6、法檢測神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達量。
　　 6、應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測心脈隆注射液對神經(jīng)干細胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、從新生SD大鼠海馬中分離培養(yǎng)的細胞具有增殖、自我更新和分化的能力，神經(jīng)球免疫化學(xué)染色Nestin、BrdU陽性，由其分化的細胞一部分神經(jīng)元特異性標(biāo)記物MAP-2陽性、一部分星形膠質(zhì)細胞標(biāo)記物GFAP陽性。
　　 2、倒置顯微鏡下觀察，與對照組相比，心脈隆注射液干預(yù)組分化出更多的神經(jīng)

7、元細胞，且免疫熒光化學(xué)染色后實驗組明顯高于對照組，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05）。
　　 3、四甲基偶氮唑鹽比色法結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)5d后，XML干預(yù)組OD值高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。
　　 4、熒光實時定量PCR結(jié)果顯示，實驗組神經(jīng)元特異性烯醇化酶表達量大于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 5、流式細胞檢測結(jié)果顯示，各實驗組和對照組之間凋亡率無明顯差異。
　　 結(jié)論: