棉鈴蟲核多角體病毒泛素基因的克隆表達(dá)及抗體制備.pdf

1、本文采用PCR方法，根據(jù)已知HaSNPV泛素基因設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，克隆了棉鈴蟲核多角體病毒泛素基因。將該基因與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α，通過酶切鑒定陽性克隆。該基因在原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中成功地進(jìn)行了高表達(dá)。將泛素基因克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)上，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-Ubi，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，通過條帶掃描分析表達(dá)量最高可達(dá)總蛋白的20﹪。

2、用His-tag抗體檢測目的蛋白，Westen-blot試驗(yàn)證明所表達(dá)的蛋白是帶有His-tag的重組融合蛋白。對該基因的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，并利用純化的蛋白制備了抗體。通過改變IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，確定最佳表達(dá)時(shí)間為1h，且當(dāng)IPTG濃度為1.0mmol/L時(shí)，融合蛋白表達(dá)量已接近最大。利用Ni-瓊脂糖凝膠親和層析柱純化目的蛋白，SDS-PAGE鑒定為單一條帶，純度可達(dá)90﹪以上，利用提純的蛋白制備了抗體，Westen-blot試驗(yàn)