家蠶和棉鈴蟲若干lethal相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲是昆蟲中的第二大目，與人類生產(chǎn)和生活關(guān)系密切，其中許多是極具危害性的農(nóng)業(yè)害蟲。家蠶(Bombyx mori)是國際無脊椎動物協(xié)會確定的鱗翅目模式昆蟲，也是唯一完成全基因組測序的鱗翅目生物，這為鱗翅目害蟲的功能基因研究提供了一個便利的技術(shù)平臺。 利用顯性致死基因來防治害蟲技術(shù)(RIDL)自2000年被提出以來，受到人們的廣泛重視。其原理是人工飼養(yǎng)攜帶顯性致死基因的雄蟲，釋放到自然界和野生害蟲交配

2、，遺傳致死基因給后代，致其死亡，從而達(dá)到控制害蟲的目的。該技術(shù)具有物種特異性、環(huán)保等特點，對農(nóng)業(yè)害蟲的防治具有重大的意義。目前RIDL技術(shù)已在果蠅中試驗成功，在鱗翅目害蟲棉鈴蟲防治方面也取得了一些成果。 為了發(fā)掘鱗翅目昆蟲的lethal相關(guān)基因，本研究分別以黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)lethal蛋白序列(P-因子誘導(dǎo)致死突變)、Triplo-lethal(三倍體或單倍體致死)基因座中Osiris基

3、因家族的蛋白序列和溫敏性致死突變基因Pros(Pros261和Prosβ21)的蛋白序列為質(zhì)詢序列，利用生物信息學(xué)、RT-PCR、RACE、表達(dá)和RNA干涉等技術(shù)克隆了家蠶的相關(guān)基因，并在棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)中克隆了3條Pros相關(guān)基因，進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析和功能研究。主要獲得了以下結(jié)果： 1．家蠶IethaI(P-因子誘導(dǎo)致死突變)相關(guān)基因的克隆及功能研究 果蠅l(3)neo18為NADH脫氫酶

4、基因P轉(zhuǎn)座子誘發(fā)的致死突變體，因此編碼的蛋白質(zhì)具有還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脫氫酶的功能。利用生物信息學(xué)、RT-PCR和RACE等方法克隆了家蠶l(3)neo18相關(guān)基因，分析了基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)譜。Bm-l(3)neo18基因的cDNA全長為868 bp，由573 bp的完整開放讀碼框(ORF)序列、25 bp的5’端非編碼區(qū)序列(5'UTR)和251 bp的3'端非編碼區(qū)序列(3'UTR)組成，編碼蛋白質(zhì)為190個氨基酸殘基

5、，分子量22．7 kD，pI為9．60。Bm-l(3)neo18基因由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，定位于家蠶第3染色體，位于nscaf2930的120．3knt-120．4knt。Bm-l(3)neo18蛋白質(zhì)在1-185氨基酸殘基位置為NADH脫氫酶的SGDH亞基保守區(qū)，在61-83氨基酸殘基位置具有一個保守的跨膜區(qū)域。采用Clustal W進(jìn)行多序列比對發(fā)現(xiàn)，Bm-l(3)neo18與埃及伊蚊等昆蟲NADH脫氫酶具有50％以上的蛋白

6、質(zhì)同源性，NADH脫氫酶的保守區(qū)域高度一致。NJ法分子進(jìn)化分析也顯示，Bm-l(3)neo18與昆蟲NADH脫氫酶進(jìn)化上同源。該基因除在卵期的表達(dá)量較低外，在幼蟲、蛹和蛾期均有較高表達(dá)，且存在組織差異性。 脫氧羥腐胺賴氨酸合酶(DHS)和脫氧羥腐胺賴氨酸羥化酶(DOHH)是催化真核翻譯起始因子(eIF5A)序列中羥腐胺賴氨酸(hypusine)合成的兩個酶。羥腐胺賴氨酸的合成是eIF5A活化成熟的標(biāo)志，對真核細(xì)胞的存活及增殖具有

7、重要作用。果蠅lethal(3) s1921為DOHH基因P轉(zhuǎn)座子誘發(fā)的致死突變體，編碼的蛋白質(zhì)具有DOHH的功能。利用生物信息學(xué)、RT-PCR和RACE等方法克隆了家蠶DHS和DOHH的相關(guān)基因BmDHS租BmDOHH，分析了基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)譜。BmDHS和BmDOHH的cDNA全長分別為1311 bp和1874 bp。BmDHS只有一個外顯子，沒有內(nèi)含子，包含最大ORF為1116 bp，編碼371個氨基酸，分子量為41．11 KD，p

8、I為5．84。BmDOHH由4個外顯子和3個內(nèi)含子構(gòu)成，包含最大ORF框為915 bp，編碼304個氨基酸，分子量為34．30 kD，pI為4．86。BmDHS編碼的蛋白質(zhì)在47-361氨基酸殘基位置為DHS的保守區(qū)域：BmDOHH編碼的蛋白質(zhì)分別在23-52，54-83，87-116，177-206，208-237，241-270氨基酸殘基位置存在E-Z type HEAT重復(fù)區(qū)域。BmDHS和BmDOHH基因所編碼的蛋白質(zhì)與人、果蠅

9、等生物均具有55％以上的蛋白質(zhì)同源性，保守區(qū)域高度一致。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示DHS和DOHH在分子進(jìn)化上存在物種特異性。表達(dá)譜分析表明BmDHS租BmDOHH在所檢測的組織中均沒有組織和時空特異性。 用4齡起蠶為材料，以?？箖龅鞍谆騞sRNA和ddH2O為對照，利用微量注射RNA干涉技術(shù)初步獲得BmDHS基因沉默表型。沉默家蠶體內(nèi)BmDHS基因mRNA水平平均下降了約25％，BmeIF5A基因mRNA水平平均下降了約4．8％

10、。注射后10 d平均體重增加了42．9％，在上簇后5 d蠶繭的重量平均值增加了35．4％。初步證明BmDHS基因在家蠶生長發(fā)育中起重要作用。 2．家蠶Osiris相關(guān)基因的克隆及表達(dá)研究 Triplo-lethal Locus(Tpl)是果蠅基因組中唯一一個具有單倍體或三倍體致死效應(yīng)的基因座。在Tpl區(qū)內(nèi)存在一個Osiris基因家族，依次命名為Osirisl-Osiris20。通過LBLASTP和PSI-BLAST分析

11、，僅發(fā)現(xiàn)3個該家族基因位于Tpl區(qū)域外，命名為Osiris21-Osiris23。該基因家族為昆蟲綱(Insecta)所特有。利用生物信息學(xué)、RT-PCR和RACE等方法克隆了家蠶6個Osiris基因家族的成員，依次命名為BmOsiris7、BmOsiris9、BmOsiris18、BmOsiris19、BmOsiris20和BmOsiris21。序列分析表明BmOsiris基因的序列ORF長度在723-882之間，所編碼的氨基酸分子量

12、大小也很接近，在26 kD-31kD之間。pI分析表明BmOsiris21為9．10，其余在6．41-8．66之間。SMART在線保守區(qū)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白家族屬于跨膜蛋白，都含有Osiris家族特有的DUF1676保守區(qū)域，支持了克隆的所有基因序列屬于Osiris基因家族的推測。Osiris家族蛋白序列進(jìn)化樹分析顯示家蠶和黑腹果蠅的同系同源蛋白要近于同物種的旁系同源蛋白。表達(dá)譜分析表明各基因在所調(diào)查的組織中均沒有組織和時空特異性，但表達(dá)

13、量的多少存在顯著差異。染色體定位結(jié)果顯示BmOsiris7，BmOsiris9，BmOsiris18，BmOsiris19和BmOsiris20定位在Chr．26上，而BmOsiris21單獨定位在了Chr．4上。家蠶Osiris基因家族的以上所有分析結(jié)果和黑腹果蠅中Osiris基因家族極其相似，推測家蠶Osiris家族的功能可能與果蠅相似。 3．家蠶溫敏性致死品系伴性赤蟻(Sch)Pros相關(guān)基因的克隆及序列比對研究

14、果蠅Pros261和Prosβ21同屬于顯性溫敏性致死突變基因，兩者分別由蛋白酶體β6和β2亞基的單核苷酸突變造成的。家蠶大造品種Pros261和Prosβ21相關(guān)基因在NCBI上已被登錄，但未見書面報道，本文分別命名為DzPros26和DzProsβ2。本實驗依據(jù)登錄的DzPros26和DzProsβ2的氨基酸序列，設(shè)計引物，在家蠶溫敏性致死品系Sch中克隆了Pros261和Prosβ21相關(guān)基因，分別命名為SchPros26和Sch

15、Prosβ2。ORF內(nèi)堿基序列比對顯示SchProsβ2和DzProsβ2的堿基序列完全一致。SchPros26和DzPros26的ORF內(nèi)堿基序列比對顯示SchPros26分別在223 bp、556 bp、621 bp、624 bp、658 bp和659 bp堿基位置發(fā)生突變。在線分析軟件分析表明堿基序列的突變導(dǎo)致其編碼蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)都發(fā)生了變化。蛋白質(zhì)功能位點預(yù)測顯示：家蠶Sch品系中由于SchPros26編碼蛋

16、白質(zhì)的第75個氨基酸殘基由甘氨酸(G)突變?yōu)榻z氨酸(S)而造成其缺少蛋白酶體β基信號位點，而正常品系大造中DzPros26編碼的蛋白質(zhì)卻具有蛋白酶體β基信號位點。這表明SchPros26可能與Sch品系的溫敏致死表型有關(guān)。 4．棉鈴蟲pros相關(guān)基因的克隆及序列分析 利用生物信息學(xué)、RT-PCR和RACE等方法克隆了棉鈴蟲Pros261相關(guān)基因，命名為Haproβ1。由于蛋白酶體β1-β7亞基都具有β亞基保守區(qū)域，之間具

17、有同源性，因此以黑腹果蠅Prosβ21為質(zhì)詢序列在棉鈴蟲EST數(shù)據(jù)庫中搜索到2條不能成為重疊群的EST序列，利用RACE和RT-PCR等方法克隆了棉鈴蟲Prosβ21的2個同源基因，命名為Haproβ5和Haproβ7。Haproβ1基因編碼蛋白質(zhì)的分子量為25．54 kD，pI為5．96，22-232氨基酸殘基為蛋白酶體β1亞基的保守區(qū)域；HaProβ5基因編碼蛋白質(zhì)的分子量為30．87 kD，pI為6．53，74．261氨基酸殘基為

18、蛋白酶體β5亞基的保守區(qū)域；HaProβ7基因編碼蛋白質(zhì)的分子量為30．07 kD，pI為8．04，40-229氨基酸殘基為蛋白酶體β7亞基的保守區(qū)域。經(jīng)比對分析顯示Haproβ1、Haproβ5和Haproβ7在不同物種間都相當(dāng)保守，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系也很相似，均與已知的物種系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系完全一致?；虮磉_(dá)譜分析結(jié)果表明：Haproβ1、Haproβ5和Haproβ7之間極其相似。都是在體壁、中腸和生殖腺中表達(dá)較高，在頭部表達(dá)量最少。這可能與