棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒（HaSNPV）orf44基因的研究.pdf

1、棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsidnucleopolyhedrovirus，HaSNPV)是一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其分子生物學(xué)和基因功能研究己取得很大進(jìn)展。開放閱讀框44(open reading frame 44,orf44)是HaSNPV的一個(gè)功能未知的結(jié)構(gòu)基因，本文首次對HaSNPV G4株基因組中的orf44基因進(jìn)行研究報(bào)道。 orf44基因

2、和Ha44蛋白序列通過生物信息學(xué)分析表明：orf44基因長1137bp，預(yù)計(jì)編碼378個(gè)氨基酸，預(yù)測蛋白質(zhì)分子大小為42KDa；orf44基因起始密碼子上游．80和-88位分別存在晚期啟動(dòng)子信號TAAG和早期啟動(dòng)子信號TATA；基因沒有明確的功能結(jié)構(gòu)域；通過PSI-BLAST比對發(fā)現(xiàn)，Ha44有多種桿狀病毒同源蛋白，這些蛋白存在于group Ⅱ NPV或顆粒體病毒屬((7rranulovirus，GV)中，其相應(yīng)的功能還未知。

3、 本試驗(yàn)中，我們用表達(dá)載體pGEX-KG及表達(dá)宿主大腸桿菌BL21對orf44基因進(jìn)行谷胱甘肽(GST)融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物約為68KDa，與預(yù)期的大小相符。表達(dá)蛋白經(jīng)初步純化(包涵體純化和凝膠電泳分離相結(jié)合)，免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。經(jīng)ELISA和western-blot檢測，獲得了特異性較強(qiáng)的抗體，為進(jìn)一步D壚4基因的表達(dá)時(shí)相分析作準(zhǔn)備。 我們利用熒光蛋白基因egfp作為報(bào)告基因，將orf44和orf44連接在真核表達(dá)

4、載體pIZ/V5-His上，形成融合表達(dá)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)染美洲棉鈴蟲細(xì)胞HzMA1，觀察GFP在熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡下綠色熒光的分布位置，將orf44基因表達(dá)產(chǎn)物Ha44定位于細(xì)胞核，這表明該蛋白可能是病毒的重要結(jié)構(gòu)基因，參與病毒基因復(fù)制與增殖。 為研究orf44基因的功能，我們通過同源重組在原核水平將該基因敲除，構(gòu)建orf44基因缺失型重組病毒。即設(shè)計(jì)一對70bp，含有orf44基因同源臂的引物，以PCR的方法合成可供同源