棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒(HaSNPV)orf109性質(zhì)的初步研究.pdf

1、棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)是一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒,其分子生物學(xué)和基因功能研究已取得很大進(jìn)展。開放閱讀框109(open reading frame109,orf109)是HaSNPV的一個(gè)功能未知基因,本文首次對(duì)HaSNPV G4株基因組中的orf109進(jìn)行研究報(bào)道。
　　 orf109基

2、因及其編碼蛋白HA109的序列經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)軟件分析后顯示:orf109全長(zhǎng)357bp,編碼118個(gè)氨基酸組成的肽鏈,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量大小為13.6kDa；orf109起始密碼子上游-235位和-238位均存在早期啟動(dòng)子特征序列CAGT,TATAA,表明orf109可能是一個(gè)早期表達(dá)基因。Ha109是HaSNPV G4株特有的一個(gè)未知功能基因,由于其具有核輸出信號(hào),推測(cè)該基因很可能在宿主細(xì)胞核物質(zhì)及能量運(yùn)輸,信號(hào)傳遞等方面起著特定作用:

3、通過(guò)同源核酸及蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)只與同種美洲棉鈴蟲HzSNPV orf112有99％以上同源性,僅具有幾個(gè)核苷酸差異,但并不影響所編碼的蛋白質(zhì)的序列,因此核酸序列的差異反映了進(jìn)化上的不同:orf109很可能是病毒在進(jìn)化過(guò)程中不斷重組和重排產(chǎn)生的新基因,但具體機(jī)理還不清楚。所以Ha109基因功能的研究對(duì)于闡明該基因的獨(dú)特性及進(jìn)化史具有重要意義。
　　 本試驗(yàn)中,我們利用表達(dá)載體pGEX—KG將orf109編碼蛋白與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(

4、GST)在表達(dá)宿主大腸桿菌BL21中融合表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物約為38.5KDa,與預(yù)期的大小相符。表達(dá)蛋白經(jīng)初步純化(包涵體純化和凝膠電泳分離相結(jié)合),免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。經(jīng) western-blot檢測(cè),獲得了特異性較強(qiáng)的抗體,為進(jìn)一步研究HA109蛋白的表達(dá)時(shí)相及其在病毒顆粒上的定位打下了基礎(chǔ)。同時(shí),我們也探索了GST—HA109融合蛋白的可溶性表達(dá)條件,我們發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要以包涵體形式表達(dá),在我們所嘗試的任何條件下可溶性融合

5、蛋白表達(dá)量都很低。
　　 為研究orf109的功能,我們通過(guò)同源重組在原核水平將該基因orf109敲除,構(gòu)建orf109基因缺失型重組病毒。首先我們通過(guò)構(gòu)建克隆的方法在pKS—egfp—Cmr質(zhì)粒 Phap70-egfp—SV40-Cmr兩端分別加上orf109的上下游同源臂,然后酶切回收帶有同源臂的ha109UP—Phap70-egfp-Cmr-ha1009D0線性片段,借助編碼λ噬菌體 Red—ET線性重組酶系統(tǒng)的質(zhì)粒pKD

6、46及棉鈴蟲桿狀病毒細(xì)菌人工染色體HaBacHz8,在大腸桿菌BW25113中進(jìn)行同源重組。通過(guò)PCR及酶切鑒定,我們得到了orf109缺失型重組病毒HaBacΔ109。
　　 為系統(tǒng)分析orf109在病毒復(fù)制周期中的作用,我們利用Bac—to—Bac系統(tǒng)構(gòu)建了帶有綠色熒光蛋白egfp基因和多角體編碼基因polyhedrin的四種基因型重組病毒:orf109缺失型重組病毒HaBacK0,orf109單回復(fù)型重組病毒HaBacSi