棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒ORF25、ORF27和ORF37基因表達(dá)的研究.pdf

1、浙江大學(xué)博士后學(xué)位論文棉鈴蟲(chóng)核型多角體病毒ORF25、ORF27和ORF37基因表達(dá)的研究姓名：劉艷荷申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士后專(zhuān)業(yè)：農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)學(xué)與害蟲(chóng)防治指導(dǎo)教師：張傳溪20030701G S T - O R F 3 7 基因的表選避l ! i 絀胞總攔內(nèi)的1 0 。4 ％。以G S T 抗體進(jìn)行W e s t e r nb l o t 分析，O R F 2 5基因和O R F 3 7 基因表達(dá)產(chǎn)物譙5 5 k D 和I 4 8 k D 處發(fā)

2、生很瀨的交義反麻，O R F 2 7 基因沒(méi)有出現(xiàn)任秘免疫條帶。因越襲臻O R F 2 5 基因和O R F 3 7 基因在大腸桿菌中郄進(jìn)行了高教表達(dá)，磊O R F 2 7基因在大腸桿菌中不能表達(dá)。網(wǎng)收O R F 2 5 基因和JO R F 3 7 基腳表達(dá)蛋白免疫家兔，制備抗體。l 蔓G S T 柱嗣牧G S T 蛋囊．對(duì)多克隆抗體按聞接E L I S A 的方法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定莆l 抗原性鞠定，表明自制的多克隆藏體具有綴離的效價(jià)。3 O

3、 R F 2 5 ，O R F 2 7 ，O R F 3 7 基因上i6 X H i s 融合碰昆蟲(chóng)細(xì)胞中發(fā)達(dá)應(yīng)用B a c t o B a t 桿狀病毒6 ×H i s 融合寢達(dá)供體質(zhì)粒，旖教襲達(dá)了O R F 2 5 ，O R F 2 7 和O R F 3 7基因。s D S —P A G E 檢潮表明O R F 2 5 基飄融臺(tái)表達(dá)產(chǎn)物為3 2 k D ，O R F 2 7 基閡融臺(tái)表達(dá)產(chǎn)物為2 3 k D ，O R F

4、3 7 基困融合表達(dá)產(chǎn)物為2 6 k D ，與g 的蛋白分子盈相符合。薄層掃描分析結(jié)粟表明，O R F 2 5 ，O R F 2 7 和O R F 3 7 基因徑昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)量分別占細(xì)胞總攝白的2 ．9 ％，7 ．7 ％幫9 ．2 ％。以H i s - T a g 齷抗避芎j ：W e s t e r nb l o t 分輯，O R F 2 5 ，O R F 2 7 承{ O R F 3 7 蒸因在表達(dá)產(chǎn)物處均顯示免疫雜變條帶，用O

5、 R F 2 5 和O R F 3 7 基因大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的魄抗多克隆抗體做W e s t e r nb l o t 分折，在表達(dá)產(chǎn)物處也顯示了明盟的免疫雜燮條帶。證明O R F 2 5 。O R F 2 7 和O R F 3 7 基霞與6 ×H i s 融合龜昆蟲(chóng)細(xì)胞中成功地進(jìn)行了表達(dá)。4 O f 強(qiáng)2 5 ，O R F 2 7 ，O R F 3 7 基因與6 X H i s + e G F P 融合在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)應(yīng)用B

6、 a c t o B a e 軒狀病毒6 ×H i s + e G F P 融合裳達(dá)供體質(zhì)粒p B a c H T e G F P T ，表選了O R F 2 5 ，O R F 2 7 和O R ．F 3 7 基因。在捌鬣凝光顯徽鏡F ，轉(zhuǎn)純O R F 2 5 ，O R F 2 7 黝O R F 3 7 基因重鰓B a c m i d的細(xì)胞都出現(xiàn)綠色熒光。S D S —P A G E 檢鋇4 表明O R F 2 5 熬聞沒(méi)有出

7、現(xiàn)特異性條帶；O R F 2 7 基困鞋舍表達(dá)產(chǎn)物為4 9 k D ，o R F 3 7 基因融臺(tái)表達(dá)產(chǎn)物出現(xiàn)5 I k D 鞠4 0 k D 蘸條特異性條帶，5 1 k D處表達(dá)蛋白與目豹蛋島分子量相符臺(tái)。薄屢掃描分析結(jié)果襲明，O R F 2 7 基因的表達(dá)量占細(xì)胞總蛋白麓3 _ 3 ％；O R F 3 7 纂園5 I k D 處蛋白表這量占細(xì)胞總礞白餐8 ．2 ％，4 0 k D 處蛋白表達(dá)疑占細(xì)照慧蟹自量5 _ 8 ％。H i s

8、 - T a g 單抗進(jìn)行W e s t e r n b l o t 分櫥，O R F 2 5 鏊弱沒(méi)蠢顯示雜交條辯，囂O(píng) R F 2 7平| l O R F 3 7 艇岡均顯示免疫雜交條帶。剛O R F 2 5 和O R F 3 7 基閃人腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的兔抗多克隆抗體做W e s t e r n b l o t 分析，O R F 2 5 基鞠沒(méi)有出現(xiàn)任何條帶，O R F 3 7 基因在表達(dá)產(chǎn)物照箍示了明顯的免痰雜交條繁。證明O R

9、F 2 5 ，O R F 2 7 和O R F 3 7 基閑與6 ×H i s + E G F P 融合，在昆蟲(chóng)細(xì)胞中都地進(jìn)行了表達(dá)，但O R F 2 5 基因的表達(dá)量很低，以致S D S —P A G E 和W e s t e r n b l o t 無(wú)法檢測(cè)。O R F 2 5 和O R F 2 7 基因6 ×H i s 融臺(tái)的表達(dá)懿遠(yuǎn)運(yùn)高丁二6 X H i s + # g 參融臺(tái)表達(dá)鮭；O R F 3 7 鏊囡