大腸桿菌植酸酶的定點突變及其熱穩(wěn)定性.pdf

1、植酸酶是酸性磷酸化酶的一種，可將有機磷水解為肌醇和無機磷。植酸酶作為添加劑，應用于養(yǎng)殖、食品加工和醫(yī)藥生產中。尤其廣泛的用于添加到動物飼料中，提高飼料中磷的利用率，提高動物的生產性能，減輕動物高磷糞便所導致的環(huán)境的磷污染。巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統(tǒng)是80年代開發(fā)的一種外源蛋白表達系統(tǒng)，具有操作難度低，易于培養(yǎng)，生長速度快，表達量高，成本低等方面的優(yōu)點，在外源蛋白的表達方面具有獨特的優(yōu)勢，被廣泛用于醫(yī)藥生產和

2、科學研究。本研究以來源于大腸桿菌的植酸酶基因為實驗材料，采用定點突變的方法，通過對密碼子優(yōu)化后的植酸酶基因appAm進一步突變，轉化畢赤酵母，通過比較各菌株產植酸酶的性質，篩選熱穩(wěn)定性好的植酸酶基因工程菌。主要內容包括：
　?、胚\用生物化學和分子生物學的相關知識，確定了6個突變位點并設計了6對分別含有6個突變位點的互補引物。將連接在pGEM-T-easy載體上的appAm基因進行單突變和疊加突變。以pPIC9為穿梭載體，通過LiC

3、1轉化方法，將各個突變體基因轉化到畢赤酵母GS115菌株中。通過SDS-PAGE和酶活檢測的方法，篩選出分別含有不同突變位點的6個陽性重組菌株(M1，K24E，K43E，C2，M2，M4)。
　?、茖ν蛔兦暗腁PPA及其6個突變體的蛋白純化方法進行了優(yōu)化，在經過硫酸銨沉淀，離子交換吸附色譜，葡聚糖凝膠色譜三步純化后，粗酶液中的色素和DNA等雜質已經基本去除，得到純度較高的蛋白，可進行下一步的功能分析。
　　⑶通過鉬藍法對各個

4、純化后的植酸酶進行酶活測定，確定各個突變體蛋白的最適溫度和耐熱性、最適pH和pH穩(wěn)定性、Km、Vm等。結果表明:突變體M2和M4的最適反應溫度提高了5℃，為65℃;突變體K24E的最適pH減小了0.5，為4.0;除C2和K43E外，其余幾種突變后植酸酶在pH2～8處理2h后，活性都能保持在80％以上;突變體M2，M4，K24E和M1仍保留50％以上的活性，而突變前的APPA在70℃處理20 min之后，就幾乎沒有殘余活性。
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