皺褶假絲酵母(Candida rugosa)脂肪酶LIP1的熱穩(wěn)定性改造.pdf

1、褶皺假絲酵母脂肪酶LIP1（Candida Rugosa Lipase1，CRL1）是一個(gè)兼具水解、轉(zhuǎn)酯、酯化等活力的多功能脂肪酶，同時(shí)還擁有著與其他七種同工酶相比更高的表達(dá)量，因此現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)藥（手性拆分）、食品、生物柴油等多個(gè)領(lǐng)域中。但 CRL1作為一種常溫酶，熱穩(wěn)定性欠佳，這一不足嚴(yán)重制約了其在工業(yè)條件下更進(jìn)一步的應(yīng)用。為此，本研究采用多種計(jì)算機(jī)輔助的理性設(shè)計(jì)方法，結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)CRL1進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造，篩選獲得熱

2、穩(wěn)定性改良且具有更強(qiáng)工業(yè)適應(yīng)性的脂肪酶催化劑。主要的研究工作及結(jié)果摘要如下：
　　1、以全基因序列密碼子優(yōu)化后的CRL1基因?yàn)樵趸?，?gòu)建N端含有6×Histag的畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα-N6×His-CRL1，并電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。隨后，鎳柱純化誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白CRL1，并對(duì)純化后的重組脂肪酶CRL1進(jìn)行了相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)表征，為后續(xù)重要參數(shù)的測(cè)定及突變體蛋白的篩選研究奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明重組CRL1的最

3、適溫度為40℃，50℃下的半衰期僅為4min，最適pH與最適底物分別為pH8.5和對(duì)硝基苯酚丁酸酯（C4）。
　　2、綜合運(yùn)用Fold X、Rosetta ddG of mutation和I-Mutant2.0這三種計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，同時(shí)對(duì)CRL1的活性中心進(jìn)行分析、篩選，排除會(huì)影響CRL1催化特性的功能位點(diǎn)，最終獲得13個(gè)可以潛在提高重組CRL1熱穩(wěn)定性的突變位點(diǎn)。
　　3、分別構(gòu)建并表達(dá)上述13種CRL1的

4、熱穩(wěn)定突變子，通過(guò)對(duì)比研究13個(gè)突變酶與原初重組酶相應(yīng)的Tm值，從中篩選獲得一株熱穩(wěn)定性顯著提高的突變子D457F，其Tm值較原初重組酶CRL1提高了9.4℃。通過(guò)對(duì)D457F突變子進(jìn)行其他熱穩(wěn)定性相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該突變體蛋白最適溫度與50℃下的半衰期較重組CRL1分別提高了10℃和6.5倍，但酶的比活力相差不大，表明457號(hào)位點(diǎn)氨基酸殘基的替換對(duì)酶蛋白的活性影響較小。
　　4、已知α-螺旋是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中最為穩(wěn)定的一種