15862.擬南芥一個(gè)假定的高親和性ni2co2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(athan)的功能解析

1、學(xué)位論文學(xué)校代碼：10225學(xué)號(hào)：S13083擬南芥一個(gè)假定的高親和性Ni2／C02轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AtHAN)的功能解析指導(dǎo)教師姓名：申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：論文提交日期：授予學(xué)位單位：任翔宇張欣欣教授東北林業(yè)大學(xué)碩士學(xué)科專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)2013年4月論文答辯日期：2013年6月13日東北林業(yè)大學(xué)授予學(xué)位日期：2013年6月答辯委員會(huì)主席：論文評(píng)閱人：聾歲厶彤素大學(xué)摘要摘要鎳是植物體內(nèi)一種必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素。它是脲酶的金屬輔基，脲酶的作用是

2、催化尿素水解，廣泛分布于細(xì)菌、真菌、藻類及高等植物中。此外在某些微生物中，鎳還是鎳鐵氫化酶、一氧化碳脫氫酶、乙酰輔酶A脫羧酶／合成酶、超氧化物岐化酶SodN和甲基輔酶M還原酶的必須組分。鈷沒有被定義為必需的營(yíng)養(yǎng)元素，但在許多種植物中均發(fā)現(xiàn)了這種元素。大量研究都表明加少量鈷對(duì)作物產(chǎn)量有積極作用，因此將其定義為有益元素。金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞、組織和器官水平上擔(dān)負(fù)著吸收及運(yùn)送金屬離子功能。目前從擬南芥中克隆到的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族主要有ZI

3、P家族、YSL家族和NRAMP家族。對(duì)微生物的研究中，發(fā)現(xiàn)了高親和性的鎳鈷離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這種高親和性鎳和鈷的吸收過程主要依賴于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和其他一些次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。目前在植物體內(nèi)鎳鈷離子的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程尚不清楚，幾乎沒有有關(guān)鎳鈷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究報(bào)道。本研究從模式植物擬南芥中，克隆得到一個(gè)基因(At4935080)，該基因編碼一個(gè)假定的高親和性Ni2／C02的轉(zhuǎn)運(yùn)體(aputativehighaffinitynickel／cobalttran

4、sporter)(簡(jiǎn)稱AtHAN)。經(jīng)測(cè)序AtHAN基因開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)為1098bp，編碼365個(gè)氨基酸，對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行了功能域分析，預(yù)測(cè)AtHAN的140364個(gè)氨基酸具有高親和地轉(zhuǎn)運(yùn)鎳鈷離子的功能，是有5個(gè)跨膜區(qū)的跨膜蛋白。將pREP3AtHAN重組質(zhì)粒和pREP3空載體轉(zhuǎn)化到酵母鎳離子吸收缺陷型菌株Aniclp中，使用原子吸收光譜法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因酵母中鎳鉆離子的含量。結(jié)果表明AtHAN參與了酵母細(xì)胞對(duì)于鎳離子和鉆離子的吸

5、收過程。但是在添加不同濃度鎳離子的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因酵母的生長(zhǎng)相對(duì)于對(duì)照沒有明顯差別；添加06mM鈷時(shí)轉(zhuǎn)基因酵母的生長(zhǎng)差于對(duì)照。我們推測(cè)酵母細(xì)胞對(duì)于鎳離子的需要量很低(nM級(jí)別)，培養(yǎng)環(huán)境中充足的鎳源足以保證酵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。過量的添加鎳離子對(duì)轉(zhuǎn)基因酵母和對(duì)照均具有脅迫作用，故生長(zhǎng)沒有明顯的差別。酵母中的亞細(xì)胞定位研究表明，AtHAN蛋白定位于酵母細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。對(duì)AtHAN基因的表達(dá)特性的研究表明AtHAN基因在花和根中的表達(dá)量較高，基

6、因的表達(dá)受環(huán)境中鎳離子和鈷離子含量的影響。將AtHAN基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBll21，并轉(zhuǎn)化到擬南芥中鑒定得到AtHAN過表達(dá)植株。相對(duì)于野生型植株過表達(dá)擬南芥對(duì)較高濃度的鈷表現(xiàn)出敏感性，而鎳處理下沒有表現(xiàn)出明顯的表型特征。40ItM、l50ItMCoCl2的處理?xiàng)l件下，過表達(dá)擬南芥植株葉中C02的積累量大于野生型，根中積累量基本相同。而NiS04處理?xiàng)l件下根和葉中的Ni2的積累量基本相同。推測(cè)AtHAN可能參與了鈷離子的運(yùn)輸，使過