16830.枯草芽孢桿菌el32分泌的彈性蛋白酶的純化及性質研究

1、簍簍大學碩士學位論文枯草芽孢桿菌EL32分泌的彈性蛋白酶的純化及性質研究PurificationandCharacterizationoftheEIastasefromBacillussubtilisEL32作者姓名：王超指導教師：堡齷副塾拯專業(yè)名稱：盒晶型堂學位授予單位：塞羞太堂論文答辯日期：2Q里2生魚月三目枯草芽孢桿菌EL32分泌的彈性蛋白酶的純化及性質研究摘要彈性蛋白是一種由Ala、Leu、Ile等非極性氨基酸殘基交聯(lián)而成的抗酸

2、堿及抗一般蛋白酶消化的硬蛋白。彈性蛋白酶是一種以特異性水解不溶性彈性硬蛋白為特征的廣譜蛋白水解酶，在食品、醫(yī)療、化妝品工業(yè)中有著廣闊的應用前景。利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)彈性蛋白酶具有高產(chǎn)量、較低的生產(chǎn)成本等優(yōu)點。國內(nèi)外有關微生物法發(fā)酵生產(chǎn)彈性蛋白酶的研究較多，主要集中在產(chǎn)酶菌株篩選、發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面，而對彈性蛋白酶的性質研究相對較少。本文對前期分離的彈性蛋白酶產(chǎn)生菌株EL32進行鑒定，并對其彈性蛋白酶進行了純化及性質研究，主要結果如下：菌株

3、EL32的16SrDNA與枯草芽孢桿菌的16SrDNA的同源性達到99％，其菌落呈乳白色，其細胞革蘭氏染色陽性，具有芽孢；發(fā)酵葡萄糖試驗產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，明膠水解試驗呈陽性，能夠水解淀粉，VP反應呈陽性，鑒定為枯草芽孢桿菌。采用硫酸銨沉淀、DEAE—Sepharose[綢離子交換層析7|：DSephacryl—SHRl00凝膠層析從枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中純化得到了電泳純的彈性蛋白酶，SDSPAGE分析顯示其分子量為31kDa。用LTQ—MS沏U

4、定肽指紋圖譜表明該彈性蛋白酶是枯草芽孢桿菌蛋白酶(substilisin)，其基因克隆表明該蛋白酶與枯草芽孢桿菌蛋白酶(substilisin)的序列同源性高達99％。對菌株EL32彈性蛋白酶的三維結構模擬發(fā)現(xiàn)His、Asp矛HSer是其活性中心的關鍵基團。枯草芽孢桿菌EL32彈性蛋白酶的最適pH值為74，pH穩(wěn)定范圍60—85，最適溫度為50。c。該彈性蛋白酶活力受至1]Fe2、Zn2、A13、Mn2、Cu2、Ca2、C02、Ba2幣

5、HEDTA的抑制，但在25％的甲醇、乙醇、二甲亞砜、異丙醇中較穩(wěn)定。以剛果紅彈性蛋白為底物，測定該酶的米氏常數(shù)‰和‰趴分別為143mg／mL禾H357U／mg；以酪蛋白為底物，該酶的米氏常數(shù)‰和‰“分別為17mg／mL矛H14286U／mg。該彈性蛋白酶能夠有效地水解牛肉，牛筋和牛蛙皮。本文鑒定了一株產(chǎn)彈性蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株，確定了其彈性蛋白酶是枯草芽孢桿菌蛋白酶，證實了該彈性蛋白酶能高效水解多種食品原料中的蛋白質，為該酶在食品工