高賴氨酸蛋白基因轉(zhuǎn)化銀耳研究.pdf

1、該研究在探索銀耳遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了高賴氨酸蛋白基因表達(dá)載體,利用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合法(REMI),首次把高賴氨酸蛋白基因?qū)脬y耳芽孢,獲得了轉(zhuǎn)基因菌株.對轉(zhuǎn)基因菌株進(jìn)行分子檢測,證實(shí)了外源基因已整合到銀耳基因組中.氨基酸含量測定表明,轉(zhuǎn)基因銀耳中賴氨酸含量得到不同程度的提高.具體結(jié)果如下:1.銀耳原生質(zhì)體制備與再生條件優(yōu)化.以芽孢、菌絲體和子實(shí)體為材料,通過正交實(shí)驗(yàn),考察了菌株、酶濃度、酶解時間以及酶解溫度對原生質(zhì)體產(chǎn)率和再

2、生率的影響,結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)材料對原生質(zhì)體產(chǎn)量影響最大,以芽孢為材料原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)到2.75×10<'7>個/ml,而菌絲體和子實(shí)體的原生質(zhì)體產(chǎn)量僅為2.5×10<'6>個/ml和1.0×10<'6>個/ml;在35℃下酶解,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高;溶壁酶濃度在1％~3％之間對原生質(zhì)體產(chǎn)量影響不大;不同菌株原生質(zhì)體產(chǎn)量差異不顯著.該實(shí)驗(yàn)還研究了穩(wěn)滲劑濃度對原生質(zhì)體再生率的影響,結(jié)果表明,0.5 mol/L~0.7mol/L的KCl對原生質(zhì)體再

3、生沒有顯著差異,再生率最高為32.3％.2.營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選.對比紫外線與γ射線對銀耳芽孢的誘變效應(yīng),γ射線誘變獲得了48個缺陷型菌株,經(jīng)傳代后都被修復(fù),沒有獲得穩(wěn)定的突變體,紫外線誘變后有62個缺陷型菌株,經(jīng)過傳代后獲得2株穩(wěn)定的缺陷型突變體,獲得兩個營養(yǎng)缺陷型菌株,其中一株Tau811經(jīng)鑒定是肌醇缺陷型.突變體Tau811的生長遲緩期比野生型多3天,生長速度較慢.3.高賴氨酸蛋白基因轉(zhuǎn)化銀耳及分子檢測.以pBR-lys為中間載體

4、,把pBR-lys的Pubi啟動子置換成P35S,構(gòu)建成表達(dá)載體pCB-lys.應(yīng)用REMI介導(dǎo)轉(zhuǎn)化銀耳芽孢,獲得眾多的轉(zhuǎn)化子,核rDNA檢測結(jié)果和營養(yǎng)缺陷型檢驗(yàn)結(jié)果表明,這些轉(zhuǎn)化子均是銀耳芽孢.PCR檢測結(jié)果:轉(zhuǎn)化子攜帶P35S啟動子、Lys基因、GUS基因、hpt基因、Tnos終止子.轉(zhuǎn)基因銀耳芽孢對潮霉素的抗性水平可達(dá)到150ug/ml以上,大部分轉(zhuǎn)化子檢測到GUS活性.4.轉(zhuǎn)基因菌株賴氨酸含量測定.利用氨基酸自動分析儀,對潮霉素