腎臟熱缺血再灌注早期損傷及益生注射液的干預(yù)機(jī)理研究.pdf

1、目的 由免疫學(xué)或非免疫學(xué)因素引起的移植物早期損傷可影響移植物短期和長(zhǎng)期有功能存活。腎臟缺血再灌注損傷(ischemiareperfusioninjury,IRI)在腎移植中不可避免，作為主要的非抗原依賴性因素，嚴(yán)重時(shí)可引起移植腎臟失功、甚至受者死亡。隨著目前等待移植的患者逐漸增多，臨床上越來越多采用邊緣供器官。而邊緣供腎或無心跳供者，常難避免過長(zhǎng)的熱缺血時(shí)間。研究顯示，30分鐘的熱缺血比24小時(shí)冷保存更具破壞性。因此，如何防治腎臟熱缺血

2、再灌注損傷對(duì)移植腎有功能存活的影響是擺在移植界面前的一大難題。若能揭示熱IRI早期損傷機(jī)制，在損傷早期即行干預(yù)，其防治效果可能最佳。 我們前期研究表明：活血化瘀中藥制劑——益生注射液(YM)能減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧再給氧損傷；降低血瘀癥大鼠血液粘度；減緩大鼠腹主動(dòng)脈移植時(shí)強(qiáng)化缺血再灌注損傷引起的血管硬化；減輕離體睪丸和移植腎的缺血再灌注損傷。本文在前期研究基礎(chǔ)上建立小鼠腎臟熱缺血再灌注損傷模型，進(jìn)一步研究腎臟熱缺血再灌注早期損

3、傷機(jī)理和益生注射液是否具有防治腎臟熱IRI的獨(dú)特整體療效及其分子機(jī)理。 方法采用小鼠腎臟熱缺血再灌注損傷模型，研究熱IRI早期損傷機(jī)理和益生注射液的干預(yù)效果及分子機(jī)理。 1)小鼠腎臟熱IRI模型的建立及益生注射液的干預(yù)效果研究：a、確定研究采用小鼠的品系。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組：昆明鼠組、Balb/c小鼠組、C57BL/6小鼠組，每組8只。建立腎臟熱缺血再灌注模型，左腎鉗夾60min，右腎切除，根據(jù)再灌注后24小時(shí)小鼠存活率

4、確定何組小鼠腎臟對(duì)熱IRI最不耐受。 b、確定小鼠左腎鉗夾的缺血時(shí)間。將小鼠隨機(jī)分為四組，每組6只：第一組：腎蒂鉗夾30min;第二組：鉗夾40min；第三組：鉗夾50min；第四組：鉗夾60min。根據(jù)再灌注后24小時(shí)腎功能檢測(cè)指標(biāo)確定何組鉗夾時(shí)間符合研究要求，即既要造成腎功能嚴(yán)重?fù)p傷，又要保持24小時(shí)生存率為80％以上。 c、確定給藥途徑為腹腔注射。YM劑量參考以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，設(shè)計(jì)小(5mg/kg)、中(15mg

5、/kg)、大(25mg/kg)三個(gè)劑量組。首先將YM原液(20mg/ml)用生理鹽水稀釋至3個(gè)濃度梯度：0.5mg/ml、1.5mg/ml、2.5mg/ml，給藥體積：0.1ml/10g體重，給藥劑量分別為：5mg/kg、15mg/kg、25mg/kg。小鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組(Sham)、模型組、YM小劑量(5mg/kg)干預(yù)組、YM中劑量(15mg/kg)干預(yù)組和YM大劑量(25mg/kg)干預(yù)組。術(shù)前12小時(shí)和30分鐘YM干預(yù)組

6、小鼠腹腔注射分別給與5、15或25mg/kg的YM，假手術(shù)組和模型組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予同樣體積的生理鹽水。@2d、小鼠腎臟熱缺血50min再灌注4h和12h后各實(shí)驗(yàn)組采集血液和缺血腎組織取樣。檢測(cè)小鼠血清尿素氮(ureanitrogen)和肌酐(creatinine)水平，腎組織作蘇木素和伊紅HE(hematoxylinandeosin)染色和高碘酸希夫PAS(Periodicacidschiff)染色，進(jìn)行病理學(xué)檢查，觀測(cè)YM對(duì)腎臟熱I

7、RI損傷有無結(jié)構(gòu)學(xué)和功能學(xué)保護(hù)作用。 2)小鼠腎臟熱缺血再灌注的早期損傷機(jī)制及益生注射液干預(yù)有效的分子機(jī)理研究：a、凋亡機(jī)制研究：HE病理組織學(xué)檢查、原位凋亡(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddUTPnickendlabeling，TUNEL)檢測(cè)腎組織原位凋亡情況、免疫組化檢測(cè)腎組織Bcl-2的原位分布和表達(dá)情況。 b、過氧化損傷機(jī)制研究：檢測(cè)腎組織中超氧化物歧化

8、酶(superoxidedismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。 c、炎癥損傷機(jī)制研究：檢測(cè)腎組織中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)含量，以反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和活化情況。ELISA檢測(cè)血清中TNF-α的含量。免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎組織中TNF-α和ICAM-1的表達(dá)部位和表達(dá)水平。RT-PCR檢測(cè)腎組織中TNF-α和ICAM-1的mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果在左

9、腎缺血60min，右腎切除后再灌注24h的模型中，與昆明鼠、Balb/c小鼠相比，C57BL/6小鼠存活率最低，提示其對(duì)腎臟熱缺血再灌注損傷的耐受性最差，對(duì)IRI損傷最敏感。確定其為本課題的研究對(duì)象。再?gòu)?0min至60min的系列時(shí)間點(diǎn)中確定小鼠左腎鉗夾的最佳缺血時(shí)間為50min，既造成腎臟的熱缺血再灌注損傷而致結(jié)構(gòu)、功能嚴(yán)重?fù)p害，又達(dá)到研究所需的存活率。 腎功能檢查發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比模型組血清中尿素氮和肌酐水平顯著升高。與

10、模型組相比，不同劑量YM(5、15、25mg/kg)干預(yù)后，血清中尿素氮水平分別下降19.9％(P＜0.05)、31.2％和43.2％(P＜0.01)，肌酐水平分別下降15.2％、24.3％和47.8％(P＜0.01)，呈一定劑量一效應(yīng)關(guān)系。腎臟組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組腎臟組織結(jié)構(gòu)正常。缺血50min再灌注24h后，腎臟組織結(jié)構(gòu)明顯異常，腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣廣泛丟失，腎小管上皮細(xì)胞受損、凋亡、壞死、脫落、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管擴(kuò)張、

11、管型形成(圖1-4B)。YM大劑量(25mg/kg)干預(yù)后，缺血腎臟絕大多數(shù)腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣相對(duì)完整(圖1-4C)，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減輕，缺血腎臟僅有散在不規(guī)則的壞死和較少的管型形成。 小鼠腎臟IRI機(jī)制及YM干預(yù)的分子機(jī)理研究顯示，IRI可導(dǎo)致腎臟發(fā)生明顯凋亡。HE病理組織學(xué)顯示模型組存在各種凋亡時(shí)期的細(xì)胞表現(xiàn)。腎組織TUNEL原位凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯多于治療組，多分布于遠(yuǎn)端小管上皮細(xì)胞。腎組織Bcl-2免

12、疫組化檢測(cè)顯示，模型組Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)，但YM大劑量干預(yù)組更為明顯，提示YM可能通過上調(diào)抗凋亡基因而減少凋亡發(fā)生，其結(jié)果與TUNEL檢測(cè)結(jié)果一致。 IRI還可導(dǎo)致腎臟過氧化損傷，表現(xiàn)為腎組織中SOD酶活性明顯降低而MDA含量明顯升高。經(jīng)不同劑量YM(5、15、25mg/kg)干預(yù)后，腎組織中SOD酶活性與模型組相比分別升高38.7％、48.3％和76.1％(P＜0.01)；MDA含量與模型組相比分別下降16.6％、25.0

13、％和35.5％(P＜0.01)。 腎臟IRI導(dǎo)致MPO含量明顯上升，反映缺血再灌注腎臟中性粒細(xì)胞招募和浸潤(rùn)程度加重；不同劑量YM(5、15、25mg/kg)干預(yù)后，腎臟MPO含量與模型組相比分別下降30.3％、42.8％和63.2％(P＜0.01)。腎臟IRI還可導(dǎo)致血清中TNF-α含量明顯升高，不同劑量YM(5、15、25mg/kg)干預(yù)后，血清中TNF-α含量與模型組比較分別下降32.9％、55.1％和74.5％(P＜0.0

14、1)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，缺血50min再灌注24h引起腎組織上TNF-α和ICAM-1表達(dá)的明顯上調(diào)。而25mg/kgYM干預(yù)后，TNF-α和ICAM-1的上調(diào)表達(dá)得到明顯抑制。RT-PCR也再次證實(shí)，YM預(yù)處理可有效降低腎臟缺血再灌注所致的TNF-α和ICAM-1mRNA水平的上調(diào)表達(dá)。Sham、模型和YM(5、15和25mg/kg)干預(yù)組總RNA提取后經(jīng)RT-PCR分析，比較各組電泳條帶強(qiáng)度與β-actin條帶

15、強(qiáng)度比值差異來反映TNF-α和ICAM-1mRNA的表達(dá)強(qiáng)弱。與Sham組相比，缺血50min再灌注4h可導(dǎo)致TNF-α和ICAM-1mRNA水平明顯升高，5、15和25mg/kgYM預(yù)處理能程度不同地抑制TNF-α和ICAM-1mRNA的表達(dá)。各組間電泳條帶強(qiáng)弱的比較顯示隨著劑量的增加，YM能顯著抑制TNF-α和ICAM-1mRNA的表達(dá)，并呈劑量相關(guān)關(guān)系。 結(jié)論1)近交系C57BL/6小鼠左腎鉗夾50min，右腎切除模型可作

16、為研究小鼠腎臟熱缺血再灌注損傷機(jī)理及干預(yù)較理想的動(dòng)物模型。 2)YM干預(yù)能有效降低小鼠腎臟熱缺血50min再灌注24h造成的血清尿素氮和肌酐水平升高。干預(yù)后腎小管上皮細(xì)胞、腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)相對(duì)正常，壞死區(qū)域明顯減少，凋亡減輕，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減輕。提示益生注射液對(duì)腎臟功能和組織形態(tài)學(xué)的損傷皆具有保護(hù)作用。 3)YM干預(yù)能有效減輕腎小管上皮細(xì)胞的凋亡發(fā)生，可通過上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)來直接抑制凋亡途徑，或通過降低過氧化

17、損傷和炎癥反應(yīng)而間接減輕凋亡。 4)YM干預(yù)可提高腎臟缺血再灌注所致下降的SOD酶活性和降低腎組織升高的MDA含量，有效減輕缺血再灌注所致腎臟過氧化損傷。 5)YM干預(yù)能有效降低缺血再灌注腎臟中MPO含量，減輕中性粒細(xì)胞的招募和浸潤(rùn)，減輕腎臟缺血再灌注小鼠血清的TNF-α水平，降低IRI所致升高的TNF-α和ICAM-1的mRNA和蛋白水平。提示益生注射液可通過有效抑制缺血再灌注腎臟中TNF-α和ICAM-1分子的上調(diào)表