12723.枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑相關(guān)基因及ribc基因的遺傳修飾

1、枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑相關(guān)基因及枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑相關(guān)基因及ribC基因的遺傳修飾基因的遺傳修飾ThegeicmodificationofpurinenucleotidebiosynthesisribCgeneinBacillussubtilis學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：劉露指導(dǎo)教師：班睿副教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一四年五月摘要核黃素是一種B族維生素（VB2），作為臨床藥品、食品和飼料添加劑，具有廣泛的應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌（Bac

2、illussubtilis）具有從無(wú)到有的核黃素合成途徑，經(jīng)過(guò)遺傳改造的菌株，能夠過(guò)量合成核黃素。枯草芽孢桿菌作為核黃素發(fā)酵生產(chǎn)菌，已成功的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。目前使用的核黃素生產(chǎn)菌株，或多或少帶有因誘變劑處理而形成的基因突變。某些未知的基因突變對(duì)菌種性能產(chǎn)生了不利影響，主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)延遲、生物量低等。誘變育種雖可獲得核黃素高產(chǎn)菌株，但不能揭示核黃素的高產(chǎn)機(jī)理。本研究采用基因工程育種方法，對(duì)枯草芽孢桿菌的嘌呤核苷酸合成途徑及核黃素轉(zhuǎn)化反應(yīng)相

3、關(guān)的基因進(jìn)行了遺傳修飾，并考察了對(duì)核黃素過(guò)量合成的影響。以核黃素操縱子組成型表達(dá)菌株枯草芽孢桿菌LX20為出發(fā)菌，采用無(wú)標(biāo)記基因修飾方法，敲除鳥苷單磷酸（GMP）還原酶基因（guaC），切斷由GMP到次黃嘌呤核苷單磷酸（IMP）的逆反應(yīng)，構(gòu)建了重組菌株LX21。在此基礎(chǔ)上，敲除腺苷琥珀酸合成酶基因（purA），切斷由IMP合成腺苷單磷酸（AMP）的分支代謝途徑，構(gòu)建了guaC和purA雙缺陷的重組菌株LX22。在菌株LX22中敲除嘌呤操

4、縱子（puroperon）阻遏蛋白編碼基因簇purRyabJ，構(gòu)建了pur操縱子轉(zhuǎn)錄起始去調(diào)控的重組菌株LX34。在菌株LX21中，采用同源重組方法，用氯霉素抗性基因替換pur操縱子的mRNA前導(dǎo)區(qū)，構(gòu)建了pur操縱子缺陷的菌株LX23。再通過(guò)同源重組方式，用cryⅢAmRNA穩(wěn)定子替換氯霉素抗性基因，恢復(fù)pur操縱子的功能，構(gòu)建了菌株LX33。再敲除LX33菌株的purA和purRyabJ，構(gòu)建了菌株LX35。采用熒光定量PCR方法，

5、檢測(cè)胞內(nèi)pur操縱子的mRNA相對(duì)水平。結(jié)果顯示，菌株LX34較LX22平均提高了10.18倍；菌株LX35較LX22平均提高了53.33倍。結(jié)果表明，在枯草芽孢桿菌中，敲除purRyabJ基因簇，同時(shí)用cryⅢAmRNA穩(wěn)定子替換mRNA前導(dǎo)區(qū)，能夠顯著提高pur操縱子轉(zhuǎn)錄水平。分別在菌株LX22、LX34和LX35的ribC基因啟動(dòng)子35區(qū)第一個(gè)堿基引入“T→C”突變，構(gòu)建了菌株LX24、LX36和LX37。熒光定量PCR的分析結(jié)果

6、顯示，ribC基因啟動(dòng)子點(diǎn)突變使其轉(zhuǎn)錄水平下降到野生型的3%。搖瓶培養(yǎng)顯示，purA、guaC、purRyabJ和ribC基因的遺傳修飾，不影響細(xì)胞的生長(zhǎng)；嘌呤操縱子的組成型表達(dá)，導(dǎo)致菌株的生長(zhǎng)延遲。ribC基因啟動(dòng)子點(diǎn)突變僅使核黃素產(chǎn)量提高約3倍，達(dá)到160mgL。結(jié)果表明，僅減低ribC基因的表達(dá)水平，不足以充分限制核黃素的轉(zhuǎn)化，不能替代編碼序列點(diǎn)突變的效應(yīng)。在ribC基因啟動(dòng)子點(diǎn)突變背景下，嘌呤操縱子組成型表達(dá)對(duì)核黃素合成的影響不