12723.枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑相關基因及ribc基因的遺傳修飾

1、枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑相關基因及枯草芽孢桿菌嘌呤合成途徑相關基因及ribC基因的遺傳修飾基因的遺傳修飾ThegeicmodificationofpurinenucleotidebiosynthesisribCgeneinBacillussubtilis學科專業(yè)：生物化工研究生：劉露指導教師：班睿副教授天津大學化工學院二零一四年五月摘要核黃素是一種B族維生素（VB2），作為臨床藥品、食品和飼料添加劑，具有廣泛的應用?？莶菅挎邨U菌（Bac

2、illussubtilis）具有從無到有的核黃素合成途徑，經(jīng)過遺傳改造的菌株，能夠過量合成核黃素。枯草芽孢桿菌作為核黃素發(fā)酵生產(chǎn)菌，已成功的應用于工業(yè)生產(chǎn)。目前使用的核黃素生產(chǎn)菌株，或多或少帶有因誘變劑處理而形成的基因突變。某些未知的基因突變對菌種性能產(chǎn)生了不利影響，主要表現(xiàn)為生長延遲、生物量低等。誘變育種雖可獲得核黃素高產(chǎn)菌株，但不能揭示核黃素的高產(chǎn)機理。本研究采用基因工程育種方法，對枯草芽孢桿菌的嘌呤核苷酸合成途徑及核黃素轉化反應相

3、關的基因進行了遺傳修飾，并考察了對核黃素過量合成的影響。以核黃素操縱子組成型表達菌株枯草芽孢桿菌LX20為出發(fā)菌，采用無標記基因修飾方法，敲除鳥苷單磷酸（GMP）還原酶基因（guaC），切斷由GMP到次黃嘌呤核苷單磷酸（IMP）的逆反應，構建了重組菌株LX21。在此基礎上，敲除腺苷琥珀酸合成酶基因（purA），切斷由IMP合成腺苷單磷酸（AMP）的分支代謝途徑，構建了guaC和purA雙缺陷的重組菌株LX22。在菌株LX22中敲除嘌呤操

4、縱子（puroperon）阻遏蛋白編碼基因簇purRyabJ，構建了pur操縱子轉錄起始去調(diào)控的重組菌株LX34。在菌株LX21中，采用同源重組方法，用氯霉素抗性基因替換pur操縱子的mRNA前導區(qū)，構建了pur操縱子缺陷的菌株LX23。再通過同源重組方式，用cryⅢAmRNA穩(wěn)定子替換氯霉素抗性基因，恢復pur操縱子的功能，構建了菌株LX33。再敲除LX33菌株的purA和purRyabJ，構建了菌株LX35。采用熒光定量PCR方法，

5、檢測胞內(nèi)pur操縱子的mRNA相對水平。結果顯示，菌株LX34較LX22平均提高了10.18倍；菌株LX35較LX22平均提高了53.33倍。結果表明，在枯草芽孢桿菌中，敲除purRyabJ基因簇，同時用cryⅢAmRNA穩(wěn)定子替換mRNA前導區(qū)，能夠顯著提高pur操縱子轉錄水平。分別在菌株LX22、LX34和LX35的ribC基因啟動子35區(qū)第一個堿基引入“T→C”突變，構建了菌株LX24、LX36和LX37。熒光定量PCR的分析結果

6、顯示，ribC基因啟動子點突變使其轉錄水平下降到野生型的3%。搖瓶培養(yǎng)顯示，purA、guaC、purRyabJ和ribC基因的遺傳修飾，不影響細胞的生長；嘌呤操縱子的組成型表達，導致菌株的生長延遲。ribC基因啟動子點突變僅使核黃素產(chǎn)量提高約3倍，達到160mgL。結果表明，僅減低ribC基因的表達水平，不足以充分限制核黃素的轉化，不能替代編碼序列點突變的效應。在ribC基因啟動子點突變背景下，嘌呤操縱子組成型表達對核黃素合成的影響不