枯草芽孢桿菌C-36內(nèi)切葡聚糖酶基因在巨大芽孢桿菌中的表達(dá).pdf

1、纖維素酶是一組復(fù)合酶的統(tǒng)稱(chēng)，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，這三種酶協(xié)同作用將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖。近年來(lái)隨著纖維素酶在棉織品水洗整理工藝及洗滌劑工業(yè)中的成功應(yīng)用，細(xì)菌纖維素酶制劑已顯示出良好的使用性能和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，纖維素酶的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用在很大程度上受纖維素酶酶活較低以及成本較高的限制。通過(guò)基因工程手段，提高纖維素酶的活性是降低纖維素酶成本的一個(gè)有效途徑。 本研究以枯草芽孢桿菌C-36內(nèi)切葡聚糖酶

2、基因?yàn)槟康幕?GenBank AccessionNo.DQ782954)，從信號(hào)肽切割位點(diǎn)序列之后設(shè)計(jì)上游引物(引入一個(gè)Bgl II酶切位點(diǎn))，在終止密碼子處設(shè)計(jì)下游引物(引入一個(gè)Sph I酶切位點(diǎn))，通過(guò)PCR去除該基因信號(hào)肽編碼序列，PCR擴(kuò)增得到大小約1.5Kb的單一條帶產(chǎn)物，即為目的基因片段。該產(chǎn)物經(jīng)酶切處理后連接到巨大芽孢桿菌表達(dá)載體pHISl525中，并轉(zhuǎn)化巨大芽孢桿菌WH320原生質(zhì)體，使之在表達(dá)載體自身信號(hào)肽的引導(dǎo)下進(jìn)

3、行融合表達(dá)。剛果紅染色表明該基因在巨大芽孢桿菌中得到了有效表達(dá)，且產(chǎn)物具有內(nèi)切葡聚糖酶活性。SDS-PAGE分析表明該酶相對(duì)分子量約為55KDa。 對(duì)基因工程菌pHBM-End培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果表明：250mL三角瓶中裝入50mL LB培養(yǎng)基(含有10μg/mL Tet)，按5％的接種量接種種齡為12h的液體種子，培養(yǎng)4h后加入終濃度為0.2％的木糖進(jìn)行誘導(dǎo)，9h后上清液中酶活可達(dá)889U/mL,是出發(fā)菌株C-36(79.2U/m