12524.crisprcas系統(tǒng)誘導(dǎo)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組突變及相關(guān)檢測(cè)方法比較

1、ANewMethodBasedonqPCRHighResolutionMeltingSystemtoDetectCRISPR／CasSysteminducedMammalGenomicMutationAThesisSubmiRedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByW

2、angkunSupervisor：ProfCaoGengshengDate：June，2014摘要現(xiàn)在的生物科學(xué)已經(jīng)進(jìn)入了后基因組時(shí)代，其主要任務(wù)就是通過(guò)生物信息學(xué)分析大量新基因的功能，揭示某些基因在動(dòng)物／人體發(fā)育過(guò)程，以及疾病發(fā)生過(guò)程的重要作用。基因組編輯能準(zhǔn)確定位，且穩(wěn)定的改造基因組遺傳物質(zhì)。作為一種理想的生物遺傳物質(zhì)的編輯方法，該技術(shù)不論是在基礎(chǔ)科研還是實(shí)際應(yīng)用中都有著廣闊的前景，它使人們能夠按照自己的設(shè)想去改造并建立穩(wěn)定遺傳的模

3、型，同時(shí)為疑難雜癥的解決提供了一定的解決方案。近年來(lái)基因組編輯的方法發(fā)展較快，到目前為止有三種方法，包括ZFN系統(tǒng)，TALEN系統(tǒng)，CRISPR／Cas9定點(diǎn)剪切系統(tǒng)。相比之下，前兩個(gè)系統(tǒng)有一定的弊端，識(shí)別效率低，打靶效果不明顯，操作復(fù)雜，而最近興起的Cas9系統(tǒng)不僅構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，同時(shí)擁有著高效的打靶效率，而且可以同時(shí)打靶多個(gè)位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)則利用Cas9系統(tǒng)，通過(guò)構(gòu)建人293T細(xì)胞的打靶載體，實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)敲除，高效率的獲得突變的細(xì)胞。并

4、且通過(guò)多種手段，包括AFLP檢測(cè)打靶位點(diǎn)的完整性，Surveyor法檢測(cè)打靶的成功率，以及HRM高分辨率熔解曲線分析不同基因的打靶效率一方面來(lái)驗(yàn)證Cas9系統(tǒng)的打靶效率，另一方面尋找一種快捷，方便的突變檢測(cè)手段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明相比經(jīng)典的突變檢測(cè)技術(shù)，HRM檢測(cè)技術(shù)似乎更加效率和精確，通過(guò)設(shè)計(jì)片段的PCR即能檢測(cè)基因打靶的效率，更加經(jīng)濟(jì)適用，而且有著PCR實(shí)驗(yàn)的所有優(yōu)點(diǎn)，高效率，高通量，高穩(wěn)定性。CRISPR／Cas系統(tǒng)的定點(diǎn)突變效率較高，

5、大約能到40％，相比ZFN以及TALEN技術(shù)有著明顯的優(yōu)勢(shì)，快速高效的系統(tǒng)更利于我們進(jìn)行基因敲除的操作，也是將來(lái)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中基因組編輯技術(shù)的主要手段。同時(shí)實(shí)驗(yàn)中獨(dú)特的gRNA的構(gòu)建也是本實(shí)驗(yàn)中的創(chuàng)新之處，實(shí)驗(yàn)中通過(guò)一對(duì)匹配靶位點(diǎn)的Oligo退火，同時(shí)利用之前構(gòu)建好的gRNA的5’和3’端進(jìn)行PCR獲得455bp的功能性gRNA片段，大大降低了之前gRNA構(gòu)建的成本，也相應(yīng)的提高了實(shí)驗(yàn)效率，并且結(jié)果通過(guò)了分子生物的檢測(cè)，與文獻(xiàn)中報(bào)道的gRN