適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因調(diào)控的人工核酶核糖開關(guān)的設(shè)計(jì).pdf

1、核酶核糖開關(guān)（ribozyme based riboswitches）是 mRNA上一段能夠調(diào)控基因表達(dá)的序列，由具有不可逆自我裂解活性的核酶和能夠特異性識(shí)別配體的適體連接而成。其中核酶結(jié)構(gòu)域的活性受到適體結(jié)構(gòu)域的別構(gòu)調(diào)控，核酶的裂解使得所在 mRNA斷裂，基因表達(dá)量下降。這種僅基于 RNA的基因調(diào)控系統(tǒng)體積小、幾乎沒有免疫原性，較常用的啟動(dòng)子誘導(dǎo)型調(diào)控系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，尤其是它們與與 AAV等基因治療載體良好的兼容性，都展現(xiàn)出廣闊的

2、應(yīng)用前景。
　　現(xiàn)有的核酶核糖開關(guān)調(diào)控倍數(shù)過低，基礎(chǔ)表達(dá)量較大，調(diào)控不夠嚴(yán)謹(jǐn)；其基本元件的選擇與結(jié)構(gòu)的組裝等仍需要優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)性能達(dá)到最佳。目前最常用的優(yōu)化方法是文庫(kù)篩選。但對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞來說，篩選過程耗時(shí)長(zhǎng)，且目的性差，不能很好地滿足優(yōu)化的需求。
　　基于核酶核糖開關(guān)的作用原理進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，是一種非常有前途的優(yōu)化方法，但目前囿于對(duì)其作用模式認(rèn)識(shí)尚膚淺，還沒有合適的模型可利用。本文綜合分析已報(bào)道核糖開關(guān)序列的作用機(jī)

3、制及結(jié)果，以核酶核糖開關(guān)主要構(gòu)象間的轉(zhuǎn)換為核心，系統(tǒng)考慮哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的主要過程，構(gòu)建了其調(diào)控基因表達(dá)的數(shù)學(xué)模型，希望該模型能全面解釋各種核酶核糖開關(guān)的作用原理。根據(jù)該模型，本文提出核糖開關(guān)主要構(gòu)象間自由能變化是基因基礎(chǔ)表達(dá)量的決定性因素，認(rèn)為此因素對(duì)于核酶核糖開關(guān)性能的優(yōu)化具有更好的參考價(jià)值。
　　基于以上模型，本文設(shè)計(jì)了一種新型核酶核糖開關(guān)。為維持核酶結(jié)構(gòu)域的活性，將茶堿適體連接到錘頭狀核酶的莖 III上，而不是已報(bào)道

4、核酶核糖開關(guān)所常用的莖 II位置。雙熒光素酶分析實(shí)驗(yàn)表明，新設(shè)計(jì)的核酶核糖開關(guān)在 Hela細(xì)胞中呈現(xiàn)出明顯的正調(diào)控性能，在1000μM茶堿濃度下，海腎螢光素酶報(bào)告基因的表達(dá)水平增加90％。與已有的同類型核酶核糖開關(guān)相比，基礎(chǔ)表達(dá)量降低了三分之二。與已有核酶核糖開關(guān)比較，新設(shè)計(jì)的核酶核糖開關(guān)性能有明顯的提高。
　　我們又進(jìn)一步通過點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，改變核糖開關(guān)主要構(gòu)象間的自由能差值，結(jié)果顯示基因的基礎(chǔ)表達(dá)量變化基本符合預(yù)期，加深了我們對(duì)核