14280.過表達(dá)cx45對生物起搏樣細(xì)胞通信連接的影響

1、碩士學(xué)位論文研究生姓名：林歡指導(dǎo)教師姓名：楊向軍教授專業(yè)名稱：心血管內(nèi)科學(xué)研究方向：心律失常的基礎(chǔ)與臨床論文答辯日期：2013年5月過表達(dá)CX45對生物起搏模型的縫隙連接通信影響的研究中文摘要I過表達(dá)CX45對生物起搏樣細(xì)胞通信連接的影響中文摘要目的：目的：應(yīng)用大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）為生物起搏的平臺(tái)，通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染獲得高表達(dá)超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道基因亞型1（hHCN1）和超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道基因亞型4

2、（hHCN4）的MSCs，將其與心室肌細(xì)胞共培養(yǎng)，構(gòu)建具有自律性的生物起搏樣細(xì)胞；并且探討過表達(dá)連接蛋白45（CX45）對生物起搏樣細(xì)胞通信連接的影響。方法方法：1.用包含hHCN1和hHCN4慢病毒載體pCH1GFPhHCN1和pCH1GFPhHCN4轉(zhuǎn)染大鼠MSCs細(xì)胞，構(gòu)建hHCN1hHCN4MSCs。同時(shí)，使用pCH1GFPhHCN1和pCH1GFPhHCN4以及不包含hHCN1和hHCN4的pCH1GFP慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染大鼠

3、MSCs細(xì)胞，構(gòu)建hHCN1hHCN4MSCs，hHCN1hHCN4MSCs和hHCN1hHCN4MSCs。通過倒置熒光顯微鏡初步觀察hHCN1和hHCN4在MSCs中的表達(dá)情況，采用RTPCR及Westernblot法檢測各組基因的表達(dá)情況。將上述四組細(xì)胞與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，通過光鏡及膜片鉗方法記錄心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率變化。2.使用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)pDsRED2N1RFPGja7轉(zhuǎn)染hHCN1hHCN4MSCs，獲得CX45穩(wěn)定表達(dá)hHC

4、N1hHCN4CX45MSCs細(xì)胞株。同時(shí)將空質(zhì)粒pDsRED2N1RFP轉(zhuǎn)染hHCN1hHCN4MSCs，形成CX45hHCN1hHCN4MSCs。使用RTPCR及Western鑒定CX45的表達(dá)情況。采用劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)記錄生物起搏樣細(xì)胞間通信連接的變化。與此同時(shí)，將三組細(xì)胞分別與心室肌細(xì)胞共培養(yǎng)，通過光鏡觀察心肌細(xì)胞自律性的變化。結(jié)果：結(jié)果：1.將四組MSCs與3d心肌細(xì)胞共培養(yǎng)2d后發(fā)現(xiàn)，hHCN1hHCN4MSCs共培養(yǎng)組