豬肺炎支原體單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是豬地方性肺炎(豬氣喘病)的病原體.該實(shí)驗(yàn)以Mhp中國株ZCF23為材料,研制出其特異性單克隆抗體,為摸索Mhp診斷新方法奠定了基礎(chǔ).1、用全菌蛋白免疫制各豬肺炎支原體單克隆抗體.用KM2培養(yǎng)基(含馬血清)培養(yǎng)Mhp ZCF23株.高速離心收獲培養(yǎng)物,用PBS懸浮沉淀.懸液經(jīng)反復(fù)凍融裂解后作為免疫原,與等量弗氏完全佐劑(首次)、不完全佐劑(后三次)混合后腹腔注射免疫

2、8周齡BALB/c小鼠(400μg/只),間隔為兩周.尾靜脈追加免疫相同劑量抗原(不加佐劑)5天后,取免疫鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤Sp2/0細(xì)胞進(jìn)行融合.用間接ELISA方法反復(fù)篩選陽性克隆,并經(jīng)有限稀釋法3次克隆化后,得到了5株分泌特異性抗體的單克隆細(xì)胞株,分別命名為:11C6、14C11、11B6-1、10C11-2和12E7-1.生物學(xué)特性鑒定表明,五株腹水單抗的間接ELISA效價(jià)均在1:10<'4>左右;免疫球蛋白亞類均為IgG<,3>

3、.免疫印跡結(jié)果表明,五株單抗所針對的抗原表位在90 kD、40 kD、70 kD和60 kD左右,而且不與馬血清蛋白反應(yīng),說明以上單抗均是針對Mhp蛋白的特異性單抗.2、豬肺炎支原體種特異性蛋白P36基因的克隆與表達(dá).已有報(bào)道,P36蛋白是Mhp種特異性蛋白,在自然感染過程中,能夠產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體反應(yīng).而且,P36基因在Mhp進(jìn)化過程中是高度保守的.該試驗(yàn)根據(jù)Genbank中P36基因序列設(shè)計(jì)了一對特異性引物,通過PCR擴(kuò)增ZCF23株P(guān)

4、36基因序列,凝膠電泳結(jié)果顯示,擴(kuò)增出948 bp左右的條帶,與預(yù)期結(jié)果相符.將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM T Easy載體中并進(jìn)行測序.結(jié)果表明,P36基因獲得了表達(dá).將其超聲波裂解后,高速離心分離上清和沉淀,分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果表明,表達(dá)產(chǎn)物GST-P36以可溶性蛋白和包涵體兩種形式存在.3.抗豬肺炎支原體P36蛋白單克隆抗體的制備.重組菌BL21(6P-1-P36)經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá),超聲波裂解后高速離心,分別收集上清和沉淀.

5、可溶性表達(dá)產(chǎn)物親和層析純化后用于檢測;同時(shí),用GST-P36包涵體沉淀與等量弗氏完全佐劑(首次)、不完全佐劑(后三次)混合后,分4次腹腔注射免疫8周齡BALB/c小鼠(400 μg/只),間隔為兩周.免疫印跡結(jié)果顯示,腹水單抗與GST-P36融合蛋白反應(yīng)而不與GST蛋白反應(yīng),并且在Mhp蛋白36kD位置也有明顯的條帶,說明細(xì)胞株5A7-2所分泌的是針對Mhp P36蛋白的單抗.P36蛋白攜帶Mhp種特異性抗原表位,并且P36蛋白多抗也不