23709.pim激酶底物識(shí)別及鑒定

1、目錄中文摘要i英文摘要ii符號(hào)說明iii1Pim激酶和elF4B研究綜述111Pim基因及其底物112Pim激酶的生物學(xué)功能213Pim激酶表達(dá)調(diào)控614Pim蛋白參與的信號(hào)途徑一715動(dòng)物細(xì)胞elF4B介紹816信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)控elF4B917elF4B對(duì)細(xì)胞生存和增值的影響1018總結(jié)與展望l12實(shí)驗(yàn)材料及方法1221實(shí)驗(yàn)材料1222實(shí)驗(yàn)方法143實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論26311療言2632實(shí)驗(yàn)結(jié)果27321真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和病毒包裝質(zhì)粒構(gòu)

2、建27322原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)30323細(xì)胞水平檢測(cè)Pim激酶對(duì)elF4B磷酸化水平的影響34324體外激酶分析GSTPim1激酶對(duì)GSTelF4B磷酸化水平的影響42325MycPim—lWT和elF4BWTFlag蛋白在Hela細(xì)胞內(nèi)共定位42326GSTpulldown實(shí)驗(yàn)43327vAbl抑制劑imatinib處理vAbl轉(zhuǎn)化的前B細(xì)胞4533結(jié)果與討論46汪君：Pim激酶底物識(shí)別及鑒定Pim激酶底物識(shí)別及鑒定碩士

3、研究生：汪君111111111111IIIIIIEIIIIIIIY2049558導(dǎo)師：孟松樹副教授陳吉龍研究員(揚(yáng)州大學(xué)，江蘇揚(yáng)州，225009：中國科學(xué)院微生物所，北京100101)摘要Pim激酶屬于絲蘇氨酸激酶，包含Pim1、Pim2、Pim3三個(gè)成員。在莫羅尼小鼠白血病病毒誘導(dǎo)的淋巴瘤中，發(fā)現(xiàn)Pim1為前病毒插入位點(diǎn)。插入Pim1的這個(gè)區(qū)域能夠增強(qiáng)Pim1mRNA的穩(wěn)定性，上調(diào)Pim1蛋白的表達(dá)。Pim1和Pim2在造血組織中高表

4、達(dá)，受多種細(xì)胞因子和生長因子的調(diào)控。上調(diào)Pim1和Pilll2激酶對(duì)細(xì)胞的增殖、細(xì)胞存活和細(xì)胞的分化非常重要。另一成員Pim3，雖然其致癌機(jī)理很少被研究，但它在動(dòng)物細(xì)胞中與Pim1有72％相似性。Pim1和Pim2激酶識(shí)別多種底物，翻譯起始因子4B(elF4B)已被鑒定為Pim2激酶的一個(gè)底物，并且Pim2激酶能直接上調(diào)elF4BSer406磷酸化水平。翻譯起始在細(xì)胞的生長，增殖等過程中非常重要，翻譯起始因子4B(elF4B)刺激elF

5、4A的RNA解旋酶活性，打開mRNA5’UTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)。elF4B是一個(gè)多功能域蛋白，參與蛋白合成的起始過程。本研究中，我們首先驗(yàn)證了Pim1激酶的底物elF4B。在293T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)除了Pim3激酶外Pim1、Pim2都能上調(diào)elF4BSer406和Ser422位點(diǎn)的磷酸化水平，而Pim1、Pim2激酶失活的突變體顯著抑制這些位點(diǎn)的磷酸化；此外，通過體外激酶磷酸化實(shí)驗(yàn)我們證實(shí)Pim1激酶能直接磷酸化elF4BSer422位點(diǎn)；GST