利用質譜技術篩選RIP3激酶下游底物.pdf

1、RIP3作為受體相互作用蛋白家族（Receptor interacting-protein RIPs）重要的一員，是具有特異的絲氨酸(Serine)/蘇氨酸（Threonine）激酶活性的蛋白。研究表明，RIP3是TNF誘導的細胞凋亡與細胞壞死相互轉換的分子開關，RIP3是TNF誘導多種細胞（如L929細胞、N細胞、MEF細胞）的壞死所必需的。因此，RIP3在誘導細胞死亡方面有著重要的作用。雖然RIP3在調控細胞壞死發(fā)揮著重要作用，但其

2、作為一個磷酸激酶，對其下游調控的底物卻知之甚少。哪些蛋白會被RIP3及其下游激酶磷酸化，在介導細胞死亡過程中RIP3與哪些蛋白相互作用，RIP3介導細胞死亡的分子機制等科學問題亟待解決。
　　 因此本論文試圖使用定量磷酸化組的方法去尋找RIP3激酶的底物，在研究中，本論文以來源于RIP3野生型小鼠和RIP3敲除小鼠的原代腹腔巨噬細胞和永生化的小鼠胚胎纖維原細胞為研究對象，分別用TNF和LPS刺激細胞，然后比較RIP3野生型成纖維

3、細胞和RIP3敲除型成纖維細胞及野生型巨噬細胞和RIP3敲除型巨噬細胞的磷酸化蛋白組的差異。文章利用一系列技術，如SILAC（穩(wěn)定同位素標記的氨基酸細胞培養(yǎng)）及其spike-in SILAC技術、FASP（超濾管輔助樣品制備）、IMAC（金屬離子偶聯(lián)親和層析）、HILIC（親水相互作用親和層析）以及納升液相串聯(lián)質譜，深入地分析了RIP3野生型細胞和RIP3敲除型細胞之間磷酸化蛋白組的不同，而且本論文證實這種方法確實可行，所得數(shù)據(jù)也具有可

4、信性。本研究鑒定到巨噬細胞中4306個蛋白的14057個磷酸化肽段和MEF細胞中1785個蛋白的4732個磷酸化肽段，其中在巨噬細胞和MEF細胞中總共篩選到14081個磷酸化位點。這些磷酸化位點中有6131個已知的磷酸化位點，而其中另外7950個磷酸化位點到目前為止還未被發(fā)現(xiàn)。同時研究中又利用生物信息學分析揭示了RIP3激酶及其下游激酶可能的底物識別基序，其中pSXP motif很可能是RIP3特異識別的基序。本論文的研究工作篩選到了一