27086.分子伴侶表達(dá)載體構(gòu)建及tev蛋白酶突變體的功能分析

1、獨創(chuàng)性：聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其它人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：時間：沙厶年多月／日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校

2、有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：第一導(dǎo)師簽名：時間：■厶年廠月f日時間：如厶年f月／日摘要mllllllllmlllll洲洲11lll㈣11IlIY1735105外源蛋白在大腸桿菌中重組表達(dá)時，常常會錯誤折疊或形成無功能的包涵體。有多種

3、方法能用于改善外源蛋白的重組表達(dá)，最常用方法是與分子伴侶共表達(dá)或融合表達(dá)，但是后者需要高效的蛋白水解酶切除融合表達(dá)的分子伴侶。本研究，構(gòu)建了含有多個大腸桿菌分子伴侶的輔助表達(dá)載體，分析了它們的功能；利用定點突變技術(shù)獲得TEV蛋白酶(tobaccoetchvirusprotease)突變體，并分析了體內(nèi)和體外的活性，獲得以下結(jié)果：1克隆分子伴侶編碼基因。克隆大腸桿菌分子伴侶基因dnaK、dnaJgrpE、groEL、groES和clpB，

4、測序結(jié)果表明克隆出的基因片段與GenBank公布的序列一致。2構(gòu)建分子伴侶表達(dá)載體。分別將分子伴侶基因插入pRSFDuet1和pCDFDuet1兩個表達(dá)載體，構(gòu)建成載體pR—GESP(含groEL、groES和grpE)和pCDJCL(含dnaK、dn甜和c伽)。3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)，SDSPAGE分析結(jié)果顯示：groEL，groES，grpE，dn水a(chǎn)ndclpB誘導(dǎo)表達(dá)的條帶明顯，但是未檢測到dnaJ的表達(dá)條帶

5、。4分析分子伴侶表達(dá)載體的效應(yīng)。共表達(dá)結(jié)果顯示，分子伴侶促進(jìn)玉米西羅葉綠三酸：鐵螯合酶和谷氨酸1半醛氨基轉(zhuǎn)移酶的可溶性表達(dá)，但是對玉米尿卟啉原III脫羧酶的可溶性表達(dá)沒有明顯促進(jìn)作用。5改造TEV蛋白酶。以TEV蛋白酶$219V為原始體，定點突變疏水性氨基酸殘基，獲得兩種TEV蛋白酶突變體(TEVQprotease，TEVrprotease)。SDS—PAGE顯示TEV蛋白酶突變體的可溶性表達(dá)水平在重組大腸桿菌中有明顯提高，每升菌液純化

6、獲得約165mg的重組TEVQ蛋白酶，108mg的TEVF蛋白酶，明顯高于報道的野生型TEV蛋白酶。6分析了TEV蛋白酶的活體和離體活性。TEV蛋白酶與含有TEV酶切位點的融合蛋白共表達(dá)，電泳顯示能有效切割融合蛋白，利用純化的TEV酶，消化純化的含有TEV蛋白酶酶切位點的融合蛋白，電泳顯示它能有效切割靶蛋白，TEVQ蛋白酶的活性明顯高于TEVF蛋白酶。綜上所述，本文構(gòu)建了兩個分子伴侶輔助表達(dá)載體并分析了它們的表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示分子伴