MPL exon10基因新突變體慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、目的:
　　 通過構(gòu)建野生型及突變型MPLexon10基因的慢病毒表達(dá)載體，包裝含有各目的基因片段的慢病毒，為后續(xù)研究MPLexon10新基因突變體MPLA497-L498LVIAins的功能奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建MPLA497-L498LVIA ins及對(duì)照基因的真核表達(dá)載體
　　 應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增MPL exon10新基因突變體(MPLA497-L498LVIA ins)及野

2、生型MPL（MPLWT）的全長(zhǎng)CDS編碼區(qū)域，分別通過酶切、連接反應(yīng)，構(gòu)建其慢病毒表達(dá)載體并依次命名為pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins及pCDH1-MPLWT重組質(zhì)粒。以pCDH1-MPLWT的重組質(zhì)粒為模板，通過定點(diǎn)誘變技術(shù)構(gòu)建MPL熱點(diǎn)突變體(MPLW515L)表達(dá)載體，并命名為pCDH1-MPLW515L重組質(zhì)粒。
　　 2.構(gòu)建MPLA497-L498LVIA ins及對(duì)照基因的慢病毒表達(dá)體系

3、　　 采用最佳的質(zhì)粒配比比例，將構(gòu)建成功的表達(dá)質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒pPACKH1-GAG，pPACKH1-REV和pVSV-G通過磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝慢病毒顆粒，用激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
　　 3.慢病毒感染293T細(xì)胞，測(cè)定病毒滴度
　　 收集的慢病毒濃縮液分梯度直接感染293T細(xì)胞，于96小時(shí)激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)，計(jì)數(shù)最后一個(gè)能觀察到熒光的孔內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，按公式計(jì)算

4、病毒滴度(TU/ml)=最后一孔熒光細(xì)胞數(shù)/稀釋倍數(shù)×103。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)酶切，測(cè)序鑒定，慢病毒表達(dá)載體pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins、pCDH1-MPLW515L和pCDH1-MPLWT重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 2.利用基因工程技術(shù)構(gòu)建三種目的基因的慢病毒表達(dá)體系，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)轉(zhuǎn)染效率分別pCDH1-MPLA497-L498LVIA ins為75.2％、p

5、CDH1-MPLW515L為81.4％和pCDH1-MPLWT為69.9％，三種慢病毒表達(dá)體系成功構(gòu)建。
　　 3.測(cè)定病毒滴度分別為MPLA497-L498LVIA ins4×108TU/ml，MPLW515L4×109TU/ml，MPLWT1×106TU/ml，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。
　　 結(jié)論:
　　 本課題設(shè)計(jì)并成功構(gòu)建MPL exon10新突變體-MPLA497-L498LVIA ins，熱點(diǎn)突變MPLW5