三種芽孢桿菌vip3A基因及特異Bt株上清液毒性成分研究.pdf

1、南開大學(xué)碩士研究生畢業(yè)(學(xué)位)論文摘要摘要雖然以蘇云金芽孢桿菌(Bt)為主的生物農(nóng)藥的相關(guān)研究有了很大的發(fā)展，但是在Bt的應(yīng)用過程中仍有許多問題需要解決。如目前仍有一些全球性重要農(nóng)業(yè)害蟲對已發(fā)現(xiàn)的殺蟲晶體蛋白仍不敏感，如鱗翅目的甜菜夜蛾，小地老虎等。另外，害蟲對廣泛使用的ICPs產(chǎn)生了抗性，對單個Cry蛋白的抗性還會引起害蟲對與之同源的殺蟲蛋白的交叉抗性。存在于發(fā)酵上清液中的營養(yǎng)殺蟲蛋白(Vip)是一類全新的殺蟲物質(zhì)，與Cry蛋白沒有任

2、何同源性。對于解決上述問題有著非常重要的意義。本文以本室多年來篩選保留，具有重要特異性的Bl以及有代表性的臘狀芽孢桿菌(Bc)和球形芽孢桿菌(Bs)菌株為試材，利用PCR方法檢測了30株Bt，19株顯示有特異擴增帶，咖甜基因菌株陽性率63％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以往文獻(xiàn)報道值(約15％)：檢測25株Bc，只有1株(B7B)顯示有特異擴增帶，這是首次發(fā)現(xiàn)含有vip3A基因的Bc菌株，對于擴大vip3A基因來源，豐富rip類基因在不同種屬中分布的知識是

3、很有意義的；檢測Bs菌株共4株，沒有菌株顯示有特異擴增帶。通過對高效特異株15A3和9816C菌株及其質(zhì)粒消除株的基因檢測，初步認(rèn)定vip3A基因定位于質(zhì)粒上。對含有vip3A基因的30株Bl菌株進(jìn)行PCRRFLP檢測分析，有四株(95125—6、L7601、7214及008)的酶切圖譜與已知的vip3A基因的圖譜不同，推測其可能至少含有三種潛在的新vip3A類基因。其克隆、測序工作正在進(jìn)行。對含有vip3A基因菌株的發(fā)酵上清液對棉鈴蟲

4、和甜菜夜蛾進(jìn)行了生物測定，發(fā)現(xiàn)半數(shù)以上菌株的上清至少對一種供試?yán)ハx有活性。利用SDS—PAGE技術(shù)分析了部分殺蟲活性較好菌株上清液的蛋白組成，發(fā)現(xiàn)vip3A基因陽性株基本都含有約885KD蛋白帶。通過熱敏試驗，以及對上清中卵磷酯酶C和溶血素的檢測排除了毒力因子是其他活性物質(zhì)的可能。通過比較15A3和9816C菌株及其質(zhì)粒消除株發(fā)酵上清液的殺蟲活性以及SDSPAGE圖譜，確認(rèn)上清液中主要的殺蟲物質(zhì)就是Vip3A蛋白。關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌