奶牛體細胞計數(shù)法與干擾素—Tau基因的克隆、表達.pdf

1、乳房炎對奶牛養(yǎng)殖業(yè)危害十分大，乳房炎的發(fā)生可以通過體細胞計數(shù)的方法進行監(jiān)測，特別對于亞臨床型乳房炎，越早監(jiān)測出越有利于預(yù)防臨床乳房炎的發(fā)生及改善牛群的整體健康狀況。目前對于體細胞計數(shù)有加利福尼亞細胞數(shù)測定(Califormia Mastitis Test，CMT)，威斯康辛乳腺炎試驗(Wisconsin MastitisTest, WMT)，電子體細胞計數(shù)法，顯微鏡直接計數(shù)法等許多方法<'［10］>，其中CMT操作簡單但只能得出體細胞值

2、的一個相對范圍，不能得到精確的值；WMT雖能得到準確的體細胞值但是實驗操作復(fù)雜；DHI操作簡單準確但需要專門的計數(shù)儀器、價格昂貴。本實驗通過熒光染色的方法，運用熒光顯微術(shù)對3個取樣點總計39頭奶牛乳汁中的體細胞分別進行三次計數(shù)，取三次計數(shù)結(jié)果的平均值作為每頭奶牛的體細胞值，并結(jié)合各奶牛場管理條件對結(jié)果進行了分析，表明吖啶橙染色是一種快速、準確的監(jiān)測奶牛體細胞數(shù)的方法，同時還表明不同的飼養(yǎng)條件及管理會造成牛群健康狀況的顯著差異，并依據(jù)實驗

3、結(jié)果對改善牛群的健康狀況提出了建議。 本實驗還根據(jù)己知的牛Bos taturus干擾素-τ(Interferon-Tau，IFN-τ)基因Genbank 登錄號分別為AF238611(IFN-τ-C3)、AF238612(IFN-τ-C2)、AF238613(IFN-τ-C1)和一個印度水牛Bubalus bubalis IFN-τ基因，Genbank登錄號AY535404的四個核苷酸序列設(shè)計出IFN-τ的克隆引物。從凍存的荷斯

4、坦奶牛血液中提取其基因組DNA，利用PCR擴增出編碼荷斯坦奶牛IFN-τ基因片斷。并利用PET-39b表達載體對其進行原核表達。結(jié)果表明，荷斯坦奶牛IFN-τ基因開放閱讀框全長588bp，編碼一個含195個氨基酸的多肽，其中前23個氨基酸為信號肽序列，余下的172個氨基酸為成熟肽，推測成熟肽分子量約為17KD。在線利用NCBI進行比對可知荷斯坦奶牛IFN-τ百基因的序列與水牛(Bubalus bubalis)、大額牛(BOS front

5、alis)、山羊(Capra hircus)、綿羊(Ovis aries)、長頸鹿(Giraffa camelopardalis)、馬鹿(Cervus elaphus)IFN-τ基因的核苷酸序列同源性分別為94.2[％]、91.2[％]、90.8[％]、90.6[％]、90.1[％]、88.4[％]。 同時利用該克隆引物首次克隆并測序了林麝、馬麝、牦牛、水鹿的IFN-τ基因，并依據(jù)測得的序列及Genbank上收錄的反芻動物IFN

6、-τ序列，并加入牛和羊的：IFN-ω及人的滋養(yǎng)層分干擾素做比較，使用MEGA3.0軟件利用neighbor-joining(NJ)法分別基于核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列的成熟肽序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，進行了分子進化與系統(tǒng)發(fā)育方面的分析，結(jié)果支持IFN-τ從IFN-ω進化來的觀點，同時討論了麝在反芻動物中的進化地位，結(jié)果支持麝作為獨立一科的觀點。 鑒于IFN-τ在反芻動物妊娠識別、抗病毒包括反轉(zhuǎn)錄酶病毒、抗細胞增殖，各種疾病的跨種的