延邊黃牛干擾素-γ基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、IFN-γ是由激活T細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子,它不僅具有Ⅰ型IFN(α干擾素、β干擾素)的抗病毒和抗腫瘤活性，更重要的是它還具有MHCⅡ類抗原表達(dá)、增強(qiáng)APC細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用、增強(qiáng)T細(xì)胞輔助抗體的產(chǎn)生和細(xì)胞毒性T細(xì)胞生長能力等諸多免疫調(diào)節(jié)活性。除治療病毒性疾病外，還可以治療腫瘤、寄生蟲病等。本研究根據(jù)GeneBank發(fā)表的牛IFN-γ基因(BoIFN-γ)序列(M29867)，應(yīng)用Primer Premier5

2、.0軟件設(shè)計(jì)了一對特異性引物，用Catrimox-14 RNA Isolation Kit Ver.2.11試劑盒提取經(jīng)ConA（半刀豆蛋白）誘導(dǎo)培養(yǎng)的延邊黃牛脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行RNA提取，通過RT-PCR技術(shù)將延邊黃牛IFN-γ基因進(jìn)行克隆并對其進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明，所克隆的延邊黃牛IFN-γ基因片段長度為446 bp，在開放閱讀框內(nèi)，編碼148個(gè)氨基酸。對所克隆的BoIFN-γ因序列與基因文庫中M29867的序列進(jìn)行比較分析,其同源

3、性為99.10％，證明該基因片段確為BoIFN-γ基因。將BoIFN-γ基因連接到pET-28a(+)原核表達(dá)載體上,陽性菌經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和測序分析結(jié)果表明，成功地構(gòu)建了含有目的基因片段的原核表達(dá)載體pET-28a(+)-BoIFN-γ。將原核表達(dá)載體pET-28a(+)-BoIFN-γ轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，融合蛋白的分子量為34 Ku。在優(yōu)化條件下，融合蛋白的表達(dá)量經(jīng)Bandscan

4、5.0軟件分析占菌體總蛋白的31.7%，表明該基因在大腸桿菌中以包涵體形式融合表達(dá)。經(jīng) SDS-PAGE分析后進(jìn)行 Western-blot鑒定，BoIFN-γ融合蛋白能與通過pET-28a(+)-BoIFN-γ免疫小鼠所得抗體發(fā)生特異性結(jié)合，而與空載體轉(zhuǎn)化菌無此特異性反應(yīng)。說明該蛋白在大腸桿菌中獲得了正確表達(dá)，并且其具有較好的反應(yīng)原性。對延邊黃牛 IFN-γ的基因片斷克隆與表達(dá)。為大量制備動(dòng)物性干擾素建立了良好體系，并為建立保護(hù)性抗原