金黃色葡萄球菌α溶血素基因的克隆、突變和表達(dá)及其在細(xì)胞玻璃化保存上的初步應(yīng)用.pdf

1、玻璃化保存技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,使血清、酶等許多生物制品在常溫下長(zhǎng)時(shí)間保存成為可能,但此項(xiàng)技術(shù)目前僅適用于非細(xì)胞性生物材料,對(duì)細(xì)胞保存效果不佳,所以研制一種新的細(xì)胞內(nèi)玻璃化保存方法顯得很有意義.該研究根據(jù)已發(fā)表的金黃色葡萄球菌α溶血素(α-HL)基因序列設(shè)計(jì)引物,用高保真PCR擴(kuò)增法從金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株1800基因組DNA中擴(kuò)增出0.9kb的α-HL基因,將其克隆入pGEM-T載體,序列測(cè)定結(jié)果顯示,所獲核苷酸序列與已發(fā)表的金黃色葡萄球菌

2、標(biāo)準(zhǔn)株Wood 46 α-HL序列同源性大于99％.為獲得可控孔形成蛋白H5,設(shè)計(jì)兩對(duì)引物來(lái)改造α-HL,以H5-5′F和H5-5′R為一對(duì)引物,用PCR方法在α-HL 5′-端引入編碼ompA信號(hào)肽序列,并將α-HL編碼第130-134號(hào)氨基酸的堿基替換為連續(xù)的5個(gè)組氨酸(His)序列;另一組以H5-3′F和H5-3′R為一對(duì)引物,用PCR方法擴(kuò)增α-HL 3′-端.將兩段PCR產(chǎn)物分別克隆進(jìn)pGEM-T載體中,測(cè)序鑒定正確后將其切下

3、同時(shí)插進(jìn)pET-30a中相應(yīng)位點(diǎn),構(gòu)建成原核表達(dá)載體pET-H5,測(cè)序結(jié)果顯示接頭部位和ORF正確.將pET-H5構(gòu)件轉(zhuǎn)入BL21(DE3)pLysS大腸桿菌中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)分子量正確的35kDa左右的H5蛋白.重組菌超聲波裂解產(chǎn)物上清經(jīng)Ni柱親和層析和酸性緩沖液透析后,獲得單一條帶的表達(dá)產(chǎn)物.用純化的H5與兔紅細(xì)胞(rRBC)作用,結(jié)果顯示H5蛋白能使rRBC溶血,HC<,50>值為180ng/ml;分子開(kāi)關(guān)試驗(yàn)結(jié)果表明,H5