豬胸膜肺炎放線桿菌檢測及其ApxⅣ基因克隆與表達.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP)是由豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)感染引起豬的一種以急性出血性和慢性纖維素性胸膜肺炎病變?yōu)樘卣鞯暮粑纻魅静?。本病呈世界性分布，在歐洲、北美洲、南美洲、大洋洲及亞洲等地區(qū)養(yǎng)豬國家均有病例報道，特別是養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)模化與集約化發(fā)展，危害程度日趨嚴重，已成為影響現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要傳染

2、病之一。1987年我國首次報道本病，1996年蔡一鳴等通過流行病學調查、臨床癥狀觀察、大體病理學檢查和病原學鑒定等首次證實本病在我省的存在。本研究開展了以下幾個方面的工作：
　　1．貴州省豬傳染性胸膜肺炎血清學調查：采用間接凝集試驗對2007年841份和2008年1056份豬血清樣本進行豬傳染性胸膜肺炎血清抗體檢測，結果顯示：2007年免疫豬群和非免疫豬群抗體陽性率分別為63.6％和50.3％，其中種豬場、規(guī)模養(yǎng)豬場、養(yǎng)殖小區(qū)、散

3、養(yǎng)戶和屠宰場豬群相應為45.4％、60.2％、44.4％、25.0％和46.8％，而在哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬和種豬中的血清抗體陽性率分別為47.6％、30.3％、62.2％和60.0％。2008年免疫豬群和非免疫豬群抗體陽性率分別為78.5％和38.0％，其中種豬場、規(guī)模養(yǎng)豬場、養(yǎng)殖小區(qū)、散養(yǎng)戶和屠宰場豬群相應為36.2％、52.2％、28.6％、12.5％和41.8％，而在哺乳仔豬、斷奶仔豬、育肥豬和種豬中的血清抗體陽性率分別為3

4、7.1％、23.5％、47.4％和42.7％。這些結果表明，該病的免疫預防效果良好，在貴州省不同飼養(yǎng)方式豬場以及不同生長階段豬群已普遍存在豬傳染性胸膜肺炎感染。
　　2．豬胸膜肺炎放線桿菌 PCR檢測技術研究：根據(jù)Genebank收錄的豬胸膜肺炎放線桿菌外膜脂白 A基因保守序列，設計合成了1對引物，對豬胸膜肺炎放線桿菌參考菌株和其它種屬菌株進行PCR檢測，并比較了不同的模板提取方法，結果顯示：建立的PCR方法對9個血清型豬胸膜肺炎

5、放線桿菌菌株均能擴增出與預期大小相一致的339bp特異性條帶，而對支氣管敗血波氏桿菌、奇異變形桿菌、都柏林沙門氏菌、埃希氏大腸桿菌、多殺性巴氏桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌等均呈陰性反應，且其模板最小檢出量可達到0.14ng；同時 SDS-蛋白酶 K法、煮沸法和槍尖法提取的DNA模板對該 PCR方法的擴增效果影響不明顯。這些結果表明，本實驗成功建立了特異、敏感的
　　豬胸膜肺炎放線桿菌PCR檢測方法，為豬傳染性胸膜肺炎的快速診

6、斷提供了技術支持。
　　3．豬胸膜肺炎放線桿菌 PCR分群研究：根據(jù)Genebank收錄的不同血清型豬胸膜肺炎放線桿菌外膜脂白 A基因序列的差異，設計合成了4對引物(即相同上游引物與不同下游引物)，對豬傳染性胸膜肺炎疫苗菌株、其它參考菌株和不同血清型豬胸膜肺炎放線桿菌進行PCR檢測，結果顯示：建立的PCR分群方法對豬傳染性胸膜肺炎疫苗菌株可擴增出983bp、666bp和382bp大小的三條 DNA帶，與該疫苗所含血清型(Ⅰ、Ⅱ和Ⅶ

7、血清型)預期擴增條帶大小相一致；對上述其它種屬參考菌株均呈陰性反應；對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ等9個血清型豬胸膜肺炎放線桿菌均能擴增出相應的目的條帶(983bp、666bp、382/415bp和591bp)。這些結果表明，本實驗建立的多重 PCR方法，可以用于豬胸膜肺炎放線桿菌血清群的劃分。
　　4．豬胸膜肺炎放線桿菌 ApxⅣ基因克隆與序列測定：根據(jù)Genebank收錄的豬胸膜肺炎放線桿菌 ApxⅣ基因保守序列，設計合

8、成1對引物，對血清Ⅰ型豬胸膜肺炎放線桿菌進行PCR擴增，并將擴增產物克隆至 pMD-18T，經轉化與鑒定后，送至大連寶生物公司測序，結果顯示：該引物對血清Ⅰ型豬胸膜肺炎放線桿菌可擴增出與預期大小相一致(約為620bp)的特異性 DNA條帶；對擴增產物的重組pMD-18T載體進行PCR和雙酶切鑒定結果均正確(分別約為624bp和624bp/2700bp)；經測序，擴增片段大小為624bp，該片段序列與Genebank上參考菌株相應序列的同

9、源性達100％。
　　5．豬胸膜肺炎放線桿菌 ApxⅣ基因原核表達及其初步鑒定：將上述擴增 ApxⅣ基因片段克隆至 pET32a載體，轉化 BL21(DE3)大腸桿菌進行誘導表達，并對表達產物進行免疫反應性鑒定，結果顯示：經藍白斑菌落篩選和PCR反應證實本實驗成功構建了豬胸膜肺炎放線桿菌 ApxⅣ基因片段的重組pET32a-ApxⅣ載體；經轉化 BL21(DE3)大腸桿菌進行誘導表達，該基因片段的表達蛋白量達到全菌蛋白的22％，最