豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌LAMP檢測方法的建立及ApxⅣ毒素部分功能研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP)是由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的并導(dǎo)致豬出現(xiàn)以胸膜炎及肺炎為特征的一種急性或慢性傳染病。近年來，本病在世界各工業(yè)化養(yǎng)豬國家中廣泛流行，給各國養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的損失，現(xiàn)被列為全球公認(rèn)的危害養(yǎng)豬業(yè)的五大傳染病之一。對于本病的預(yù)防多采用菌體滅活苗來進(jìn)行，但由于APP血清型眾多

2、，且各血清型間的交叉保護(hù)力有限，加之滅活苗缺少APP在生長過程中分泌的毒素，而這些毒素已經(jīng)被證明了APP重要的保護(hù)性抗原及滅活過程中抗原成分存在或多或少破壞及丟失的情況，滅活苗在預(yù)防本病的效果上并不十分突出。所以，對于本病新型疫苗的研究已經(jīng)成包括國外在內(nèi)的很多研究人員的關(guān)注，已經(jīng)成為豬傳染病領(lǐng)域的一個熱點。本研究分成兩個部分，具體如下:
　　第一部分，為克服現(xiàn)有檢測APP技術(shù)中所存在的操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴、耗時長等問題，本研究通過D

3、NAstar等軟件對血清1-12型的APP的dsbe-like基因進(jìn)行序列比對，找出其中同源性較高的序列，利用在線引物設(shè)計軟件設(shè)計了4條LAMP引物，并對LAMP方法的各種反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了25μl的反應(yīng)體系。在特異性檢驗中，利用LAMP方法對豬身上常見的幾種病進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，只有用APP核酸作為模板時才可出現(xiàn)陽性反應(yīng)，說明本LAMP方法具有較好的特異性;在靈敏性檢驗中，通過對APP核酸進(jìn)行梯度稀釋，發(fā)現(xiàn)本LAMP方法的最低檢

4、測極限為5個拷貝/反應(yīng)，是已報道的PCR方法的20倍。最后，分別利用細(xì)菌分離、PCR及本LAMP方法對外表健康豬肺臟與疑似感染APP豬肺臟進(jìn)行檢測以探索本LAMP方法在檢測臨床樣品中的表現(xiàn)，結(jié)果顯示，在外表健康豬組中細(xì)菌分離、PCR方法、LAMP方法的檢出率分別為0％、2％、4％，而疑似感染組中三種方法的陽性率分別為6.98％、58.14％、69.77％，且LAMP與細(xì)菌分離、PCR方法的陽性符合率為100％，說明本LAMP方法更加適合

5、于APP的臨床檢測。綜上，加之，本LAMP反應(yīng)反擁有的成本低廉、不需要專業(yè)的操作技能等諸多優(yōu)點，能較好地滿足目前對豬傳染性胸膜放線桿菌現(xiàn)場檢測的迫切需要，對防止我國豬接觸傳染性胸膜肺炎病的發(fā)生和控制該病的流行應(yīng)該有重要意義。
　　第二部分，通過分析比對APP5型的ApxⅣ基因序列，利用DNAstar等軟件分析ApxⅣ基因中的可能存在抗體表位區(qū)并設(shè)計一對引物擴(kuò)增出ApxⅣ基因序列中463-1261這一片段，并將其連接至pMD18-T

6、質(zhì)粒成功構(gòu)建克隆載體，再通過酶切將目的片段連接至pET21 a(+)成功構(gòu)建表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21，通過各位表達(dá)條件的優(yōu)化，成功表達(dá)了目的蛋白，經(jīng)過經(jīng)過破碎菌體及SDS-PAGE檢測，蛋白以包涵體的形式表達(dá)。將重組表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化、復(fù)性步驟后，經(jīng)Western-blot抗原性分析表明所得到的重組蛋白純度較高且具有良好的反應(yīng)原性。再通過鹽析的方法提取了APP5型的ApxⅠ、ApxⅡ兩種溶血外毒素。最后，將滅活的含有不同劑量的重組表

7、達(dá)ApxⅣ與滅活的ApxⅠ、ApxⅡ、滅活菌使用白油為佐劑分別制備疫苗，采取背部多點注射的方式免疫小鼠，再以我國常見的血清5型的強(qiáng)毒株以10倍于LD50的劑量進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示，各組疫苗中隨著重組ApxⅣ含量的增加，其免疫保護(hù)率也隨之升高，表明本研究所重組的ApxⅣ能提供給免疫小鼠對相同血清型細(xì)菌攻毒一定的免疫保護(hù)作用。綜上所述，重組的ApxⅣ作為額外成分添加后可增強(qiáng)亞單位疫苗的免疫保護(hù)力，但是，至于是如何提高滅活苗免疫保護(hù)效果的，其機(jī)