豬胸膜肺炎放線桿菌尿素酶的提取及特性研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumonia;APP)引起的一種豬呼吸道傳染病，世界各國均有發(fā)生，尤以歐、美各國流行嚴(yán)重。各種年齡的豬均易感染，并常與巴氏桿菌等混合感染。臨床癥狀以病豬呼吸困難為特征，病理變化主要是肺部不同程度的充血、出血和纖維素性肺炎，其發(fā)病率和死亡率常在20％以上，最急性型的死亡率可高達(dá)80％～100％，如果發(fā)展為慢性或潛伏于豬群內(nèi)，可使豬生長緩慢，飼養(yǎng)成本增加，抵

2、抗力下降。該病在我國的發(fā)生呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 構(gòu)成APP致病的毒力因素包括溶血毒素、莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白、蛋白酶、滲透因子、尿素酶等。研究.APP毒力因子的致病作用有利于毒力因子亞單位疫苗或基因工程疫苗的研究，同時對有效疫苗的選擇和應(yīng)用，預(yù)防和控制本病也具有重要意義。 本研究主要分兩個部分： 第一部分：豬胸膜肺炎放線桿菌尿素酶的提取純化及理化特性研究。

3、 胸膜肺炎放線桿菌在樣品緩沖液中經(jīng)超聲波破碎后，4℃、10000r/min離心20min取上清得到粗提的尿素酶，再經(jīng)過硫酸銨鹽析和SephadexG-200凝膠過濾層析進(jìn)行提純，由SDS-PAGE電泳檢測提取物的純度并測定分子量，以及對尿素酶的理化特性，包括pH(6.0、6.5、7.0、7.5、7.7、8.0、8.5、9.0、9.5)和溫度(25、30、35、40、45、50和55℃)對尿素酶活性的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，APP尿

4、素酶由三個亞單位組成，其分子量分別為11.0、25.0和60.OKD；該酶的最適pH為8.5，最適溫度為45℃，在該條件下測得酶比活為96.253U/mg。 第二部分：豬胸膜肺炎放線桿菌尿素酶對小鼠免疫原性研究。 將制備的APP尿素酶分不同劑量(5、10、15、20、25和30u g／只)免疫小白鼠，然后進(jìn)行同源保護(hù)性試驗。結(jié)果尿素酶在25 μ g/只的免疫劑量下可對小白鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)作用。用同血清型菌株對免疫后的小白

5、鼠攻毒，病理學(xué)變化為對照組未經(jīng)免疫直接攻毒的小白鼠全部死亡，肺臟嚴(yán)重出血，肝臟腫大出血，而免疫組除免疫5 μ g組的小白鼠全部死亡、肺臟出血嚴(yán)重，肝臟腫大出血外，其他組小鼠的死亡率呈下降趨勢，與對照組相比，肺臟出血輕微：病理組織學(xué)變化為對照組肝細(xì)胞壞死崩解，肺泡內(nèi)出血嚴(yán)重，肺間質(zhì)增厚，間質(zhì)內(nèi)出血；免疫組也有類似病變，但程度不同，逐漸減輕。表明尿素酶在豬傳染性胸膜肺炎的免疫保護(hù)過程中起一定的作用，該研究為APP亞單位疫苗的研制及應(yīng)用提供了