豬胸膜肺炎放線桿菌感染特異性診斷方法的建立：PCR和夾心ELISA.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的一種高度接觸傳染的呼吸道疾病，給集約化養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，該病以出血性壞死性肺炎和纖維素性胸膜炎為特征，APP有兩個(gè)生物型，15個(gè)血清型。 豬傳染性胸膜肺炎最急性型引致豬的急性死亡，無(wú)臨床病癥慢性感染豬往往是再次爆發(fā)和流行的潛在傳染源，感染豬易引發(fā)其它病原的繼發(fā)感染。所以APP感染的早期診斷成為防控該病的關(guān)鍵

2、。 APP致病機(jī)理非常復(fù)雜，有眾多毒力因子，Apx(A. pleuropneumoniae-RTX-toxins，Apx)是最重要的毒力因子。其中apxⅣ基因只在活體內(nèi)表達(dá)，體外培養(yǎng)則不表達(dá)該毒素，apxⅣ基因存在于所有血清型中且高度保守，具有種特異性。 本研究致力于提高、完善APP感染的診斷技術(shù)，建立PCR診斷方法并開(kāi)發(fā)研制夾心ELISA試劑盒。 1、建立APP生物I型的PCR診斷方法 PCR是一種

3、快速的病原學(xué)診斷方法，本研究據(jù)已發(fā)表的apxⅣ毒素基因序列(登錄號(hào)：CS056137，位置：1543~2418)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立檢測(cè)APP1～12血清型的PCR方法。血清型1~12標(biāo)準(zhǔn)菌株和5株野毒株均能擴(kuò)增出預(yù)期876bp片段，而副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌、豬放線桿菌、豬霍亂沙門(mén)氏菌、奇異變形桿菌、支氣管敗血波氏菌、豬丹毒桿菌PCR擴(kuò)增結(jié)果為陰性?？蓹z出最低活菌數(shù)為2x102cfu/mL，最低檢出DNA濃度為9pg。 2、

4、重組蛋白rApxⅣ的表達(dá) 參照GenBank中已發(fā)表的apxⅣ序列(登錄號(hào)：CS056137)設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，擴(kuò)增血清1型標(biāo)準(zhǔn)菌株apxⅣ基因963bp片段(位置：2518~3480)，PCR產(chǎn)物經(jīng)Ndel、Notl酶切處理后克隆到同樣處理的質(zhì)粒pET-22b(+)中，酶切鑒定和序列分析后將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E coli BL21(DE3)，0.1 mM IPTG誘導(dǎo)4h獲得高效表達(dá)的重組蛋白His-ApxⅣ，SDS-PAGE、

5、Westem blot檢測(cè)證實(shí)rApxⅣ分子量為35.3KDa，以可溶狀態(tài)存在，含His-Tag。融合蛋白經(jīng)Novagen公司的固定化鎳離子親和層析試劑盒進(jìn)一步純化。 3、單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的建立 按常規(guī)方法制備單克隆抗體。以純化的重組蛋白rApxⅣ免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合，以rApxⅣ和表達(dá)宿主菌的菌體蛋白為檢測(cè)抗原，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選，三次亞克隆后挑選兩

6、株分泌穩(wěn)定、為IgG的雜交瘤細(xì)胞：SB7、SC11，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)證明它們有不同的抗原結(jié)合表位。這兩株單抗制得腹水的ELISA滴度分別為1:6.4×104，1:1.28×105，以(NH4)2SO4鹽析法純化單抗。純化的587用標(biāo)準(zhǔn)生物素方法進(jìn)行標(biāo)記并測(cè)得標(biāo)記效價(jià)為106。建立檢測(cè)ApxⅣ毒素的雙抗體夾心ELISA方法，方陣滴定法確定捕獲抗體最佳工作濃度為4μg/mL，Biotin-587最佳工作濃度為0.8μg/mL，rApxⅣ最低檢