尼羅羅非魚T細(xì)胞激活相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、羅非魚是一種在全世界廣泛養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)魚類，近年來，以鏈球菌病為代表的羅非魚病害頻繁發(fā)生，給羅非魚產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了該產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。由于其較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)羅非魚病害的研究逐漸成為水產(chǎn)動(dòng)物病害防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而由無乳鏈球菌引起的鏈球菌病是其中一個(gè)主要的研究方向。然而，目前關(guān)于羅非魚的T細(xì)胞，特別是關(guān)于T細(xì)胞激活方面的研究還十分有限。CD59、CD2BP2和Lck是三種與共刺激分子CD2存在互作的關(guān)鍵蛋白分子，在CD2

2、介導(dǎo)的T細(xì)胞激活中起到著至關(guān)重要的作用。為了解羅非魚T細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)寄生菌的免疫應(yīng)答機(jī)制，本研究以尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）為研究對(duì)象，克隆了尼羅羅非魚CD59、CD2BP2和Lck的cDNA序列全長(zhǎng)，并對(duì)其組織分布、對(duì)無乳鏈球菌刺激的免疫應(yīng)答以及功能特征進(jìn)行了初步的研究。
　　CD59是一種重要的補(bǔ)體抑制蛋白和T細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白，在非特異性免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答中都發(fā)揮著重要的作用。在本研究中，尼羅羅非魚

3、的CD59基因（簡(jiǎn)稱為On-CD59）被成功克隆，序列分析結(jié)果表明On-CD59的cDNA全長(zhǎng)為1176bp，包含一段長(zhǎng)為74bp的5'端非編碼區(qū)、一段長(zhǎng)為748bp的3'端非編碼區(qū)以及一段長(zhǎng)為354bp、編碼117個(gè)氨基酸的開放式閱讀框(ORF)。On-CD59所推測(cè)的氨基酸序列具有已知CD59分子所具有的五大特征結(jié)構(gòu)，包括N端的信號(hào)肽、C端的GPI錨定區(qū)、中間的LU結(jié)構(gòu)域、CCXXXXCN基序以及10個(gè)半胱氨酸殘基。在健康的羅非魚中

4、，On-CD59 mRNA的表達(dá)在本研究所檢測(cè)的所有組織中都能被檢測(cè)到，其中在腦的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他組織;在經(jīng)滅活無乳鏈球菌刺激24h后，On-CD59 mRNA在皮膚、大腦、頭腎、胸腺和脾臟的表達(dá)都發(fā)生了顯著的上調(diào)。此外，在滅活無乳鏈球菌刺激后，On-CD59的表達(dá)在皮膚、腦、頭腎、胸腺和脾臟表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性表達(dá)模式，On-CD59在皮膚的表達(dá)水平于免疫12 h后達(dá)到峰值，而在腦和頭腎則是于免疫24 h后達(dá)到峰值，在胸腺和脾臟到達(dá)

5、峰值的時(shí)間最晚，為免疫48h后。補(bǔ)體抑制活性試驗(yàn)結(jié)果表明On-CD59不但具有補(bǔ)體抑制活性，而且這種活性具有物種選擇性。而生物素-鏈霉親和素ELISA以及集落形成單位試驗(yàn)結(jié)果則分別表明，On-CD59能結(jié)合革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的主要組分PGN和LTA，并對(duì)無乳鏈球菌具有一定的抗菌活性。
　　CD2BP2是幾種與CD2胞質(zhì)區(qū)結(jié)合的接頭蛋白之一，在CD2介導(dǎo)的T細(xì)胞激活以及核剪接中都起著關(guān)鍵的作用。在本研究中，尼羅羅非魚的CD2BP2基

6、因(簡(jiǎn)稱為On-CD2BP2)被成功克隆，序列分析結(jié)果表明On-CD2BP2的cDNA全長(zhǎng)為1429bp，包含一段長(zhǎng)為111 bp的5'端非編碼區(qū)、一段長(zhǎng)為193bp的3'端非編碼區(qū)以及一段長(zhǎng)為1125bp、編碼374個(gè)氨基酸的開放式閱讀框。On-CD2BP2所推測(cè)的氨基酸序列具有已知CD2BP2分子所具有的兩大特征結(jié)構(gòu)，即C端的GYF結(jié)構(gòu)域和GPFXXXXMXXWXXXGYF基序，且其所推測(cè)的基因結(jié)構(gòu)與已知的CD2BP2分子十分相似。

7、在健康的羅非魚中，On-CD2BP2 mRNA在頭腎、脾臟和肝臟的表達(dá)量較高;在經(jīng)滅活無乳鏈球菌刺激48h后，On-CD2BP2 mRNA在頭腎、脾臟和腦的表達(dá)都發(fā)生了顯著的上調(diào)。此外，在滅活無乳鏈球菌刺激后，On-CD2BP2在頭腎、脾臟和腦的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性表達(dá)模式。On-CD2BP2在腦的表達(dá)水平于免疫24h后達(dá)到峰值，而在頭腎和脾臟則是于免疫48h后達(dá)到峰值。
　　Lck在關(guān)于T細(xì)胞的分化、增殖和效應(yīng)功能的信號(hào)轉(zhuǎn)

8、導(dǎo)中都起著至關(guān)重要的作用。在本研究中，尼羅羅非魚的Lck基因（簡(jiǎn)稱為On-Lck）被成功克隆，序列分析結(jié)果表明On-Lck的cDNA全長(zhǎng)為2213bp，包含一段長(zhǎng)為286bp的5'端非編碼區(qū)、一段長(zhǎng)為421bp的3'端非編碼區(qū)以及一段長(zhǎng)為1506bp、編碼501個(gè)氨基酸的開放式閱讀框。On-Lck所推測(cè)的氨基酸序列具有對(duì)于轉(zhuǎn)導(dǎo)TCRs信號(hào)所不可缺少的幾個(gè)結(jié)構(gòu)特征，且其所推測(cè)的基因結(jié)構(gòu)與已知的Lck分子十分相似。在健康的羅非魚中，On-L