尼羅羅非魚Ikaros基因克隆、組織表達及抗無乳鏈球菌相關SNP位點篩選.pdf

1、羅非魚是世界上最重要的水產養(yǎng)殖品種之一，具有生長快、繁殖力高、適應性強和食性廣等優(yōu)點，已在世界各地進行了廣泛引種與養(yǎng)殖。但是自2009年以來，羅非魚鏈球菌病在羅非魚養(yǎng)殖中大規(guī)模暴發(fā)且頻繁發(fā)生與流行，給羅非魚養(yǎng)殖產業(yè)造成了巨大的經濟損失。培育羅非魚抗病品系是解決羅非魚鏈球菌病害的重要途徑之一。分子標記輔助育種是一種高效的育種方法，利用分子標記可以定向選育羅非魚抗病品系，增加選育強度從而加速其遺傳改良進程。單核苷酸多態(tài)性（single nu

2、cleotide polymorphism,SNP）因具有標記數量多且易于檢測等特點成為MAS中最為常用的分子標記。Ikaros是一種C2H2型鋅指蛋白類轉錄因子，對淋巴細胞的正確發(fā)育及其免疫功能的正常發(fā)揮具有重要作用，但其在羅非魚中的研究還未見相關報道。因此，開展尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）免疫相關候選基因Ikaros基因的相關功能研究，并從中篩選抗病相關SNP分子標記，這可為實現(xiàn)分子標記輔助羅非魚抗病選育

3、奠定基礎。
　　本研究對尼羅羅非魚Ikaros基因的cDNA序列和基因組DNA序列進行了克隆，對基因的結構特征、組織分布及其對無乳鏈球菌感染的響應進行分析，初步了解Ikaros基因的生物學功能；對Ikaros基因5’調控區(qū)序列中的SNPs進行檢測，并與無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）抗性進行相關性分析，以期獲得抗病相關的SNPs，為尼羅羅非魚遺傳育種研究提供新的分子標記，研究結果具體如下：
　　

4、1.尼羅羅非魚Ikaros基因的克隆與組織表達
　　本試驗采用RT-PCR和RACE等方法克隆了尼羅羅非魚Ikaros基因的cDNA序列以及利用PCR和染色體步移技術克隆了Ikaros的基因組DNA序列。對Ikaros基因序列分析發(fā)現(xiàn)，Ikaros基因組DNA為20454 bp，包括7個內含子和8個外顯子，經可變剪接可形成6種不同的mRNA剪接異構體，其編碼的氨基酸序列均具有Ikaros家族典型的鋅指結構域且與硬骨魚類Ikaros

5、氨基酸序列同源性較高（70.6％~93.7%）。采用實時熒光定量PCR分析了Ikaros mRNA在尼羅羅非魚中的組織分布及其對無乳鏈球菌感染的響應。結果顯示，Ikaros基因在健康尼羅羅非魚11種被檢測的組織或器官中均有表達，其中在血液中的表達量最高，其次為胸腺、脾臟和頭腎。人工感染無乳鏈球菌后，血液、胸腺、脾臟、頭腎中Ikaros基因的相對表達量均顯著上調，并在48h達到峰值，這表明Ikaros基因參與調控尼羅羅非魚抵御無乳鏈球菌的

6、免疫應答反應。
　　2.尼羅羅非魚Ikaros基因5’調控區(qū)序列的克隆與分析
　　通過染色體步移法從尼羅羅非魚的基因組中克隆獲得Ikaros基因5’調控區(qū)序列，長度為4178 bp。使用在線生物信息學軟件對Ikaros基因5’調控區(qū)序列進行預測與分析，預測尼羅羅非魚Ikaros基因的轉錄起始位點位于起始密碼子（ATG）上游931 bp位置，核心啟動子位于轉錄起始位點-57 bp~48 bp的區(qū)間；預測的Ikaros基因啟動子

7、區(qū)域具有真核生物啟動子基本結構元件：TATA框、CCAAT框、八聚體元件等。轉錄因子結合位點預測顯示，在Ikaros基因5’調控區(qū)-2200 bp~1200 bp的序列中存在豐富的轉錄因子結合位點，包含GATA-1、Homeobox、CDP CR3+HD、AP-1等。CpG島分析顯示Ikaros基因具有2個CpG島，分別位于啟動子和第一外顯子上。
　　3.尼羅羅非魚Ikaros基因5’調控區(qū)序列的SNPs及其與無乳鏈球菌抗性的關聯(lián)

8、分析
　　采用直接測序法在親本（F0）尼羅羅非魚的Ikaros基因5?調控區(qū)序列中篩查到5個SNPs，分別將其命名為SNP1（g.562,G＞A）、SNP2（g.217,G＞T）、SNP3（g.-53,C＞T）、SNP4（g.-220,T＞C）和SNP5（g.-579,T＞C）。經分析發(fā)現(xiàn)這些SNPs均分布在啟動子的各種調控元件中，可能會對 Ikaros基因的精確表達產生重要影響。通過Snapshot方法對5個SNPs在子一代（F

9、1）尼羅羅非魚易感群體和抗病群體中進行基因分型及與無乳鏈球菌抗性進行關聯(lián)分析，結果發(fā)現(xiàn)SNP2（g.217,G＞T）、SNP3（g.-53,C＞T）、SNP4（g.-220,T＞C）和SNP5（g.-579,T＞C）的基因型頻率和等位基因頻率在易感群體和抗病群體中存在顯著差異（P＜0.05），表明這4個SNPs與無乳鏈球菌抗性顯著相關。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，這5個SNPs可形成一個單倍塊和5種單倍型，其中GGCTT單倍型與抗病性顯著相關（