膠體金免疫層析和實時熒光PCR在分枝桿菌快速檢測與鑒定中的應用研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學2011級博士學位論文膠體金免疫層析和實時熒光PCR在分枝桿菌快速檢測與鑒定中的應用研究RapiddetectionandidentificationofmycobacteriabycolloidalgoldbasedimmunochromatographicassayandrealtimefluorescentPCR課題來源：自籌經費學位申請導師姓專業(yè)名培養(yǎng)類培養(yǎng)層所在學人尹小毛名王前教授稱臨床檢驗診斷學型學術型次博士研究

2、生院南方醫(yī)院答辯委員會主席答辯委員會委員高天明吳曉蔓李林溫旺榮鄭衛(wèi)東裘字容鄭磊教授教授教授教授主任技師教授教授2014年5月19日廣州摘要高；DNA指紋方法需要酶切分析，也存在操作繁瑣和成本較高的缺點；測序法是分子鑒定的金標準，但由于需要特殊的設備和很高的技術要求，一般難以在臨床實驗室開展。上世紀末研究人員應用膠體金標記的抗MPT64單克隆抗體開發(fā)了一種用于MPT64檢測的膠體金免疫層析試劑盒，并將其用于分枝桿菌培養(yǎng)物的檢測，可達到快速

3、鑒別MTC與NTM的目的。近年來新建立的一種基于rpoB基因擴增的雙重實時熒光PCR方法，因不需要使用探針進行雜交而具備了成本低廉的優(yōu)勢，加上實時PCR快速簡便的特點，該方法也具備代替?zhèn)鹘y(tǒng)生化方法用于常規(guī)臨床檢測的潛力。那么上述兩種分枝桿菌快速鑒別方法究竟哪種性能更好還是各具優(yōu)勢如果各具優(yōu)勢，我們應如何在臨床實驗室工作中對它們進行取舍，取舍的依據以及每種取舍所帶來的結果又是什么，而第一部分研究所要解決的正是這些問題。不同DNA雙鏈由于其

4、序列長度和序列組成不同，產生的熔解曲線特征也不同，因而可通過熔解曲線分析進行區(qū)分。高分辨熔解曲線分析(Highresolutionmeltingci／rveanalysis，HRMA)是在普通熔解曲線分析的基礎上發(fā)展起來的一種高度靈敏的DNA鏈分析方法，能檢測到DNA鏈中單個堿基的替換。既然上述的雙重實時PCR可通過產物的熔解曲線分析來快速鑒別MrC和NTM，那么是否可以在此基礎上通過結合HRMA來進一步將NTM鑒定到種呢rpoB基因在

5、分枝桿菌中是單拷貝基因，而且各種分枝桿菌的rpoB基因也存在序列差異，理論上應用它來鑒定NTM可獲得比多拷貝基因更好的效果，故第二部分內容主要是應用單重實時熒光PCR結合HRMA來快速鑒定NTM并評價其準確性。分枝桿菌的鑒別和鑒定主要以培養(yǎng)物作為檢測對象，而分枝桿菌的培養(yǎng)常需數周時間，如果能直接檢測痰液等臨床標本中的分枝桿菌，那么將大大縮短診斷和治療的周期。結核病的發(fā)病率和患病率遠高于非結核分枝桿菌病，故檢測臨床標本中的MTC意義更大，